胶体金法与ELISA法检测抗CCP抗体用于诊断RA的比较研究

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[摘要] 目的 比较两种检测抗CCP抗体方法的优劣。 方法 用胶体金法与ELISA法对患者血清进行抗CCP抗体检测，两种方法结果不符的以临床明确诊断确认。结果 胶体金法灵敏度85%，特异性为97.5%，假阳性率2.5%，假阴性率为15%；同ELISA法比较得出阳性符合率为98.8%，阴性符合率为98.4%。结论 两种检测方法的灵敏度和特异性无差异，均较高，

[关键词] 胶体金；ELISA；抗CCP抗体；类风湿性关节炎

[中图分类号] R7 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2015）10（a）-0025-03

类风湿关节炎（ rheumatoid arthritis， RA） 是常见的自身免疫性疾病，以关节滑膜慢性炎症为主要表现。目前抗环瓜氨酸肽（anti- cyclic citrullinated peptide， 抗CCP）抗体的检测方法为酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunoabsorbent assay ， ELISA） [1]，因其检测试剂对环境及保存条件的限制，在基层医院的检验科和门诊中较难实现该项目的实验检测。胶体金免疫层析法（gold-immunochromatography assay，GICA）因对试剂保存条件与实验室环境要求不高，而且，试剂包装简易，可以单独对一份标本进行试验，其操作简便、快速，结果直观，稳定性好等，应用于抗CCP抗体检测，可快速筛选类风湿性关节炎，使类风湿性关节炎的早期诊断变成现实；满足基层医院、即时检测、床边检测的需求，将拥有巨大的市场潜力和效益[2]。该文以2013年6月—2014年7月收集的200例RA患者为研究对象，对两种诊断产品的临床检测性能进行评估研究，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2013年6月—2014年7月来自鸡西市矿业集团总医院确诊为200例RA患者，所有患者均符合美国风湿病协会1987年修订的RA诊断标准[3]；同时选择来该院进行健康体检的健康人员100例和非RA患者100例作为对照组；两组人员基本情况比较差异无统计学意义（P>0.05）。血清标本抽取三组人员晨起空腹静脉血3～5 ml，离心后血清标本储存预 -70℃冰箱中待测。

1.2 试剂来源

抗CCP抗体检测胶体金法试剂盒由上海科新生物技术股份有限公司提供；抗CCP抗体（ELISA法）试剂盒为欧洲诊断试剂公司生产；仪器：安图96孔酶标仪，25℃恒温箱，科华洗板机。

1.3 检测方法

分别采用胶体金免疫层析法和间接ELISA法来检测患者血标本中是否含有抗CCP抗体。操作按照各自试剂盒说明书进行，质控品、标准品均作复孔且与标本同时检测。质控品检测结果符合质控要求。抗CCP抗体检测试剂盒（胶体金法）采用高度特异性的抗原抗体反应及免疫层析分析技术，测试时，血清标本滴入加样处，血清标本中的IgG与预包被在聚酯膜上的胶体金标记的二抗结合，结合物随之在毛细效应下横向层析。当血清中含有特异性抗CCP抗体时，泳动到T线时被预先包被在硝酸纤维素膜上的抗原捕获，出现阳性条带，血清中若不含待测抗体时，在T线处继续横向层析至C线，C线为预先包被非特异性抗原，结合物在C线处被捕获，此反应为非抗原特异性的反应，作为对照条带，因此无论血清是否含有特异性的抗CCP抗体均在C线处形成阳性条带。抗CCP抗体胶体金法检测结果参考范围为阴性，ELISA法：< 25RU/mL。对于试验研究中测定结果明显不符的样本，将比对方法或其它方法再次重复进行确认试验，同时由临床试验方根据患者的具体相关临床症状和其它用以诊断该疾病的特异性指标报告加以分析，提供不符样本的患者临床相关资料以便对临床研究结果进一步分析，并作记录。

1.4 统计方法

该研究所有数据均使用SPSS 17.0统计学软件处理分析，应用配对四格表卡方χ2检验，使用Kaapa来检验两种检验方法检测结果的一致性，P<0.05表示比较差异有统计学意义

2 结果

2.1 胶体金法检测抗环瓜氨酸抗体的诊断灵敏度、特异性分析

通过对该研究三组人员采用胶体金法检测抗环瓜氨酸抗体诊断的灵敏度及特异性分析得知，200例RA患者诊断的灵敏度为85%，假阴性率为15%；100例健康献血者诊断的特异度为98%，假阳性率为2%；100例非RA患者诊断诊断的特异性为97.0%，假阳性率为3%，健康献血者+非RA患者诊断的特异度为97.5%，假阳性率为2.5%，见表1。

表1 胶体金法检测抗CCP抗体用于诊断RA的特异性

2.2 胶体金法与ELISA法检测结果比较分析

通过对两种方法检测结果汇总统计分析，计算两种检测方法的阳性符合率：169/171×100%=98.8%；阴性符合率：223/229×100%=98.4%；总符合率：（169+223）/200=98.0%；试剂盒一致性评价：由计算公式：Kappa=[N（A+D）-（γ1C1+γ2 C2）]/[N2-（γ1C1+γ2C2）]，其中γ1=A+B，C1=A+C， γ2=D+C，C2=B+D，N=A+B+C+D得出：Kappa=0.959262 > 0.75。P值的计算公式是P=2[1-Φ（z0）]两者总符合率可以达到98.0%，见表2。

表2 两种方法检测结果比较

3 讨论

类风湿性关节炎属于自身免疫性疾病，病因尚未明了，以慢性、对称性、多滑膜关节炎和关节外病变为主要临床表现，是一种慢性全身性炎症性疾病。类风湿属于致残性疾病，关节损害是类风湿患者最主要的病变，患病2年即可出现不可逆的骨关节破坏，如果不能诊治可出现严重的关节畸形，有些病人也会出现血管损害。类风湿性关节炎（RA）在我国发病率约为0.3%，女性患者居多。RA的早期诊断，一直是各国医学专家关注的问题[4]。现行的美国风湿病学会（ACR）诊断标准主要依靠临床表现、X线以及类风湿因子（RF）检测。当患者达到诊断标准时，患者已出现骨关节破坏，而且，类风湿因子缺乏特异性，不利于早期诊断、早期干预治疗[5]。类风湿的早期诊断可依靠环瓜氨酸的检测。Nicola等[6]研究发现环瓜氨酸抗体与人的性别、年龄没有相关性，但与早期类风湿密切相关。Schellekens[7]等研究了数百例有早期关节症状患者，随访一年后在486人中发现149人（31%）为早期RA，检测抗CCP抗体特异性达96%，阳性预测值为84%。小关节侵蚀性病变有时会出现在系统性红斑狼疮和类风湿的早期。抗环瓜氨酸抗体与类风湿的临床症状及预后相关。Schellekens研究发现抗环瓜氨酸抗体阳性是侵蚀性关节损害的一个重要标志及危险因素，并指出检测抗CCP抗体与联合检测抗CCP抗体和RF相比较，对预测2年后侵蚀性关节损害无统计学差异。Vallbracht等[8]人的研究显示，RA病人在应用DMARDs和糖皮质激素冲击治疗期间，抗CCP抗体的水平明显下降，提示抗CCP抗体可作为临床判断疾病活动的指标，并指导治疗。目前市场上商品化抗CCP抗体检测试剂盒也主要为ELISA试剂盒。ELISA法操作程序烦琐，整个过程需三小时左右，亦需要专业人员在实验室中进行实验操作，并需酶标仪读取结果，这在基层医疗机构的实验室和小型门诊中较难实现，同时基于ELISA法易受温度和孵育时间等环境条件因素的影响，对试验带来诸多不便[9]。胶体金免疫层析法（GICA）是应用胶体金标记技术，以胶体金作为示踪物，以条状纤维层析材料为固相，通过毛细效应使样本溶液在层析条上层析，使样本中的待测物与金标垫上胶体金标记物发生免疫反应，并与条状纤维层析材料上的抗原（或抗体）发生免疫反应而被截留，进而形成肉眼可见的红色条带，得到直观的实验结果，达到快速检测的目的。与其他检测方法相比，胶体金免疫层析法方法（GICA）有以下优点：①整个检测过程在5～10 min就能完成，结果判断简单方便；②操作人员无需专业培训，操作简便，能在门诊室、家庭用户及基层实验室推广使用；③无需低温保存，储运方便等；④其检测性能如稳定性好，能保存24个月；灵敏度与市售定性ELISA试剂盒相当，能快速筛选阳性样本，使得胶体金层析试剂条备受欢迎。

通常产生胶体金方法漏检原因考虑有以下几种：原因及方法学差异，如层析过快，抗原与抗体未来得及结合即已越过检测线；试纸条本身的质量问题；试剂本身的灵敏度较ELISA低；温度影响，温度过低，反应速度降低，在5 min内弱阳性不能完全显色；加样量不足或过多；工作人员未按时间要求报结果等，而ELISA法灵敏度高，漏检度低，但检测时间长，操作复杂。人血清中含有内源性物质（非特异性干扰物质），影响ELISA的测定结果，并且血清中抗体与异质抗原间的交叉反应也能在ELISA中发生多种非特异性吸附作用，导致假阳性的出现。

该产品将环瓜氨酸肽引入试纸条中，能快速筛选出抗环瓜氨酸肽抗体阳性样本，对快速辅助诊断类风湿关节炎起到积极作用，实现基层实验室、即时检测、床边检测的需求，同时利用ELISA法能够定量检测抗体浓度的优势，对检测结果为阳性的患者作者建议用ELISA法定期监测抗CCP抗体浓度变化以监控疗效指导医生制定个性化治疗方案和判断预后[6]。

[参考文献]

[1] Canbay E，Ishibashi H，Sako S，et al.Preoperative carcinoembryonic antigen Level predicts prognosis in patients with pseudomyxoma peritonei trented with cytoreductive surgery and hyperthermic inteaperitoneal chemotherapy[J]. World J Surg，2012，37（6）：1271-1276.

[2] Wdelman MJ，Hodgson L，Rosenblatt PY，et al.CYFRA21-1 as a prognostie and predictive marker in adwanced non-small-cell lung cancer in a prospective teial ：CALGB150304[J].J Thorac Oncol，2012，7（4）：649-654.

[3] J Avouac， L Gossec， M Dougados. Diagnostic and predictive value of anti-cyclic citrullinated protein antibodies in rheumatoid arthritis： a systematic literature review[J].Ann Rheum Dis， 2006，65（7）：845-851.

[4] Vincent C， Simon M， Sebbag M， et al. Immunoblotting detection of autoantibodies to human epidemis filaggrin： a new diagnostic test for rheumatoid arthritis[J]. J Rheumatol， 1998，25（5）：838-846.

[5] Kroot EJJA， de Jong BAW， Van Leeuwen MA， et al. The prognostic value of anticyclic citrullinated peptide antibody in patients with recent onset rheumatoid arthritis[J]. Arthritis Rheum， 2000，43（8）：1831-1835.

[6] Nicola B， Giovanni M， Elio S， et al. Diagnostic accuracy of the anti-citrulline antibody assay for rheumatoid arthritis[J]. Clin Chem， 2001， 47（6）：1089-1093.

[7] Schellekens GA， Visser H， de Jong BAW， et al. The diagnostic properties of rheumatoid arthritis antibodies recognizing a cyclic citrullinated peptide[J]. Artritis Rheum， 2000，43（1）：155-163.

[8] Vallbracht I， Helmke K. Additional diagnostic and clinical value of anti-cyclic citrullinated peptide antibodies compared with rheumatoid factor isotypes in rheumatoid arthritis[J]. Autoimmune Rev， 2005，4（6）：389-394.

[9] Lee AN ，Beck CE，Hall M ，et al.Rheumatoid factor and anti-CCP autoantibodies in rheumatoid arthritis；a review[J].Clin Lab Sci，2008，21（1）：15-18.

（收稿日期：2015-07-07）