侧枝萌发诱导基因（LIF）的原核表达与农杆菌介导转化麻风树幼

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摘要：麻风树（Jatropha curcas L.）的有限分枝是限制麻风树油产量的最主要因素之一，为了奠定基因调控麻风树分枝的基础，研究并优化了侧枝萌发诱导基因LIF（lateral shoot-inducing factor ）的原核表达条件，并成功获得了重组蛋白。通过研究农杆菌浓度、抗生素浓度建立了稳固高效的麻风树农杆菌（（LBA4404）高效转化体系；将LIF基因转入麻风树基因组中，通过GUS染色、PCR、Southern blot检测，确定了LIF基因已经成功转化入麻风树基因组中，获得了高达（23.91±5.78）%的转化率。

关键词：麻风树；侧枝萌发诱导基因（LIF）；幼叶；农杆菌

中图分类号：Q943.2 文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0014-06

收稿日期：2014-08-28

基金项目：国家自然科学基金（编号：51308464）；西南交通大学科技创新项目（编号：A0920502051405-62）。

作者简介：宗桦（1981—），女，江苏宜兴人，博士，讲师，主要从事植物学研究。E-mail：14744632@qq.com。属于大戟科的麻风树（Jatropha curcas L.）是一类具有极强抗旱性的大灌木或小乔木，其种子中含油丰富，并能较容易地转化成纯度能满足美国和欧洲标准的生物柴油[1]。此外，麻风树油还可应用于制造肥皂、化妆品、染料等产品[2-4]。然而，由于麻风树的种子产量较低，极大地限制了麻风树油的推广应用。迄今为止，提高麻风树种子的产量仍是一件十分困难的事情，这是由于麻风树的种子产量受到多种因素影响，如自然环境[5]、麻风树的分枝形态[6]、基因型[7]、经营管理方法[8]等。在这些因素当中，麻风树结果母枝的分枝形态被认为是最重要的制约因素之一，因此许多学者认为增加麻风树结果母枝的数量就能有效地提高麻风树种子的产量[8-9]。

近年来，世界各国都开始关注植物分枝发育控制机理的研究，通过采用包括突变体分离、定位、克隆相关基因和相关基因分析等分子生物技术等方法，不断加深对植物分枝发育的认识。目前在许多物种，如矮牵牛[10-11]、烟草[12]、番茄、豌豆、玉米、水稻和拟南芥[13]中都开展了突变体作为分枝的变化模式研究。2005年，Nakagawa等从矮牵牛中克隆出了侧枝萌发诱导基因LIF，是目前唯一一个被报道的分枝基因[14]。

Nakagawa等研究发现，LIF基因在矮牵牛、烟草、拟南芥中过量表达均可以导致植株分枝明显增多，高度明显降低，叶片小化[14]，由此Nakagawa等推断，LIF基因在双子叶植物中能保守地表达，可以调控双子叶植物的分枝[14]。进一步研究发现，LIF编码的蛋白属于一种TFⅢA型锌指蛋白，具有这种类型结构域的蛋白一般是结合DNA作为转录因子参于多种植物的调控过程。然而由于LIF被发现的时间短，因此针对LIF诱导的蛋白的功能研究还未开展。再加上植物分枝的形成是一个受多种因素影响的复杂的生物学现象，因此，针对单个基因开展蛋白纯化研究对于了解其在植物形态构成上的功能有一定的难度。而通过重组的方式在大肠杆菌中进行原核表达为LIF基因的功能研究提供了一个良好的途径。众所周知，大肠杆菌是现代分子生物学研究中最常用的材料之一，目前除了己经掌握了它的分子生物学和分子遗传学方面的大量资料外，在基因表达方面也有深入研究。大肠杆菌遗传背景清楚，容易培养，能大规模发酵，并具有大量可供选择利用的克隆和高效表达载体[15]。

本研究构建了LIF原核表达载体，转入大肠杆菌BL21中，将转化子进行诱导表达，获得重组蛋白，摸索表达的最优条件，为进一步探讨LIF的功能奠定基础。同时，将LIF基因转入麻风树基因组，了解LIF基因在麻风树中的表达方式，为基因调控麻风树的分枝做好准备工作。

1材料与方法

1.1植物材料和菌株

试验所用矮牵牛（Petunia hybrida Vilm）种苗种植在温室（14 h光照/10 h黑暗，室温22 ℃）中。成熟麻风树种子来源于攀枝花市。种苗种植于盛满沙和营养土的塑料盆钵中，于温室中生长2个月（16 h光照/8 h黑暗，室温28 ℃）后，取第1～3节上的叶片用作试验。灭菌后的麻风树幼叶切成为 1 cm2 的小块，接入愈伤组织诱导培养基中预培养2 d。

Escherichia coli菌株BL21、农杆菌菌株LBA4404均为笔者所在实验室保存。

1.2矮牵牛LIF基因开放阅读框获得和原核表达载体构建

1.2.1LIF基因ORF的扩增提取矮牵牛的RNA，用Oligo （dT）18为引物进行反转录，反转录产物作为模板，设计引物lof33、lof52进行PCR扩增ORF序列。酶切位点（下划线部分）分别为BamHⅠ、HindⅢ。引物序列如下：lof33：5′-CCCAAGCTTTCATAAGAACTTTCTTGTGCCTAAACC-3′；lof52：5 ′-CGCGGATCCATGGAAACTAGTAAAAATCAGCCGTC-3′；反转录引物：Oligo （dT）18：5′-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG （T）18-3′。反应条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃ 40 s，62 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，34个循环；72 ℃延伸10 min。将PCR产物电泳后进行回收，回收按照DNA胶回收试剂盒的说明步骤进行。

1.2.2原核表达载体的构建原核表达所用质粒载体选用pET32[16]，含有T7启动子、6个His标签，具有Amp抗性。将胶回收的片段连接到pMD19-T载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态获得转化子pMD19-T-LIF，摇菌1 h后涂LB平板，37 ℃过夜培养。于第2天挑菌，摇菌后送样测序。经测序检测获得LIF的ORF片段后，摇菌提质粒。用限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ双酶切载体pET32，胶回收线性载体。用T4连接酶连接目的片段与线性载体（均带有BamHⅠ、HindⅢ黏性末端）。16 ℃连接过夜，获得重组子pET-LIF （简称PL）。随后将重组子转入大肠杆菌BL21感受态细胞获得转化子PLB，摇菌后提取质粒，采用酶切、菌落PCR和测序等手段检验目的片段是否正确。同时也将空载pET32用同样的方法转入大肠杆菌BL21以获得空白对照转化子pET32-Empty （简称PE）。引物均由上海英骏生物技术有限公司合成。