十字花科根肿病的研究进展

摘 要：概述了根肿病的危害与发生、病原菌的基本特征、病原菌的分离提纯与人工接种方法以及十字花科大白菜抗根肿病的研究等。

关键词：根肿病；芸薹根肿菌；抗根肿病

中图分类号：S436.3 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.04.020

根肿病是由芸薹根肿菌（Plasmodiophora brassicae） 引起的一种十字花科（Cruciferae）植物的世界性病害。该病于1737年首次发现，现已蔓延至全世界，在温带地区此病发生率最高[1]。感病植物有花茎甘蓝、白菜、芜菁、花椰菜、芥菜、萝卜、撇蓝等。作为一种土传病害，根肿病的病原菌在土壤中的存活时间能达到8年以上[2]。休眠孢子在无感病寄主植物的土壤中甚至可以存活20年[3]。近些年 ，该病的发病率持续升高，根肿病发生带来的直接后果就是十字花科植物大面积减产，严重影响蔬菜的产量。

1 根肿病病原

根肿病的病原菌为芸薹根肿菌。该病原菌属根肿菌目。关于根肿菌目的分类地位，目前尚有争议。但可根据Ainsworth在《菌物词典》中所述，将此病原分为原生动物界、根肿菌门、根肿菌纲、根肿菌目、根肿菌科、根肿菌属、芸薹根肿菌[4]。根肿病菌的休眠孢子大小3.5 μm左右，萌发产生游动孢子。游动孢子直径2.5～3.5 μm，前端有两根长短不等的鞭毛，在水中能游动，静止后呈变形体状。

2 根肿病的发生

根肿菌病原菌主要危害十字花科植物的根部。休眠孢子在适宜的条件下萌发成游动孢子，游动孢子侵入寄主组织的根毛，进而进入寄主细胞内并形成变形体。受侵染后的根组织大量增生，主根和侧根形成数目和大小不等的膨大肿瘤。肿瘤的产生影响根的正常生长以及吸收能力。发病初期，植物地上部分几乎不受影响，只在高温晴朗天气时表现出叶片下垂、萎蔫，晚上就能恢复。后期，植物的病情加重，生长迟缓，叶片变黄，甚至脱落，形成永久性的萎蔫，严重的使植物死亡。病根中的休眠孢子囊在肿根腐烂后会残留在土壤内，以待再次侵染以及度过不良环境[5]。根肿菌休眠孢子萌发的温度为10～30 ℃，最适温度24 ℃，致死温度45 ℃。土壤相对湿度为60%～98%时最利于发病。太干的土壤不利于发病。此外，弱酸性的土壤最利于发病，最适pH值为5.4～6.5，pH值大于7.2时病害发生减轻。

3 根肿菌的分离提纯

根肿病菌是一种寄生在植物组织中的专性寄生菌，不能独立生长。这就给对它的研究增加了难度，所以菌体的分离提纯成为研究根肿菌的重要技术。关于根肿菌的提纯，Macfarlane[6]最早采用的方法是，将根肿组织研磨、过滤，反复离心后得到根肿菌休眠孢子。但若长期保存，悬浮液中其他微生物的存在和繁殖会对休眠孢子产生影响。Castlebury[7] 在Macfarlane方法的基础上提出了一种提纯根肿菌的改进方法。从被浸染的根系组织中提取根肿菌，通过一系列的离心，用50%的蔗糖溶液和蒸馏水离心之后，再通过连续梯度的LUDOX（硅溶胶，二氧化硅悬浮在NaOH中，pH=9.8）。此法能够提取纯净的根肿菌休眠孢子并且能够长期保存。杨佩文[8]提纯根肿菌时通过研磨、过滤、反复离心，在沉淀中加50%的蔗糖溶液悬浮后离心取上清。这样，可以除去休眠孢子中混有的细菌、植物根组织、淀粉、土壤颗粒以及其他微生物等杂质，分离到较纯的休眠孢子提取液。邓洁等[9]认为孢囊是孢子在植物组织中的存在形式，提纯后仍会有粘连，采用蔗糖梯度方法不能实现植物碎片和杂菌的完全去除，4 ℃下杂菌会增殖，LUDOX方法准备复杂，而滤膜法又使孢子大量损失，从而提出采用蔗糖梯度离心与超声波破碎法结合来纯化孢子。这能在较短时间内获得高纯度的休眠孢子，在细菌培养基上只有一种杂菌即枯草芽孢杆菌休眠体。

4 根肿菌的人工接种

由于根肿菌是专性寄生菌，所以建立稳定的带菌活体系统尤为重要。目前，针对十字花科根肿病的接种方法有以下几种。

（1）注射法。丁云花[2]认为此法简便易行且效果好。具体做法为：取新鲜或-18 ℃低温保存的发病根组织，搅碎，经纱布过滤后反复离心。弃去上清，用蒸馏水悬浮沉淀物，将接种液调至孢子浓度为1×108个· L-1的悬浮液。将发芽的种子播于消毒土中。取接种液2 mL注射于根际基质。

（2）蘸根法。Williams[10] 认为该法最好。先制备根肿菌孢子接种液，然后将10 d左右苗龄的无病虫幼苗取出，根部用水洗净，吸干水分。将根部浸入接种液中浸泡数小时后，将幼苗移植回原来的培养基质中。

（3）菌土法。用珍珠岩作基质，将菌根磨碎并均匀混于无菌土中，放入珍珠岩基质事先挖好的小穴中。然后将出芽的种子移栽到菌土中。黄蓉[11]又将菌土法分为普通菌土法、密封菌土法、浸种+菌土法、浸种+密封菌土法4种方法。普通菌土法即将根肿组织打碎，菌根和土按1∶200（W/W）的比例混合成含水量为60%左右、pH值为5.5的菌土。白菜种子均匀播撒在含菌土的育苗塑料盘中。密封菌土法同普通菌土法相同，只是用塑料膜将配好的菌土密封，48 h后填入育苗塑料盘中。浸种法即种子在菌液中浸泡5 h后，再均匀播撒在育苗塑料盘中。试验结果表明，各种接种方法都能使白菜感病，但接种效果因方法不同而表现出差异。密封菌土法接种优于普通菌土法。浸种法接种效果虽然低，但浸种法与密封菌土法复合接种法发病率和病情指数高，为最佳的接种方法。

5 大白菜抗根肿病的研究

由于根肿病危害损失大，防治困难。抗根肿病的研究就显得尤为重要。

早在1989年，日本的吉川宏昭[12]就将抗病芜菁77 b、ECD2号选系与感病的结球白菜松岛新2号杂交，将抗性基因转育到结球白菜上。得到F1、F2和回交一代、二代的群体。F1完全抗病，F2抗病和感病的分离比例为3∶1， 回交一代的分离比例为1∶1，回交二代都是抗病的。该研究表明，77 b的抗性是由显性基因控制的，该基因可用于培育白菜类作物的抗根肿病品种，特别是结球白菜。谭翀等[13]从云南省玉溪和安宁地区的患病白菜根中采菌，并用菌土法对来自国内外的18个抗根肿病大白菜品种进行抗病性鉴定。结果表明：CR-惠民、康根51和泰能舒根3个品种发病率分别为0，0，4%，对该生理小种均有抗性。且CR-惠民和康根51的田间经济性状优良，可作为云南省安宁、玉溪地区大白菜抗根肿病育种的材料。张敬文等[14]人发现外形美观、丰产的新品种CR589大白菜为抗根肿病大白菜。该种于2008—2010年分别在山东、云南、贵州、湖北以及四川等地进行了3季多点抗性试验。结果表明，该品种均抗根肿病、且同时抗病毒病和软腐病。胡靖锋等[15]用菌土法对从云南地区得到的110 份十字花科作物做抗根肿病鉴定。结果表明：芜菁表现为高抗，它对根肿病的抗性要高于其他种类材料，甘蓝类材料和甘蓝型油菜材料间抗性无差异，花椰菜及青花菜材料对根肿病的抗性最弱。目前，日本和韩国使用的抗源基因均来自欧洲饲用芜菁。

沈阳农业大学的聂凯[16]利用细胞核雄性不育“复等位基因”遗传假说，将“msmsrr”基因型大白菜品系转育成抗根肿病雄性不育系，育成了经济性状优良的抗根肿病雄性不育甲型“两用系”和临时保持系。耿新翠[17]在此基础上，以抗根肿病普通心甲型雄性不育“两用系”和桔红心自交系为试材，进行了抗根肿病桔红心大白菜核基因雄性不育系的转育，实现了抗根肿病、桔红心和核不育源的综合利用。陈慧慧[18]筛选出与大白菜抗根肿病基因CRb紧密连锁的分子标记，并将CRb基因定位在0.18 cM的2个有较高通用性的共显性标记之间。她指出，大白菜抗根肿病基因有8个，分别有Crr1、Crr2、Crr3、Crr4、CRa、CRb、CRc和CRk。利用抗根肿病（clubroot resistance，CR）基因培育抗病品种是防治大白菜根肿病的最经济而且有效的方法。

6 总结与展望

迄今，我国对于十字花科根肿病的研究尚处于初级阶段。该病具有遗传机理复杂，发病后波及范围广，侵染后难以彻底根除等特点。而且引发该病的病原菌芸薹根肿菌不能被离体培养，必须寄生在十字花科植物的根部才能够萌发。这就导致研究的培养周期长，难度大。以目前的分离提纯技术，在培养基中建立稳定的带菌活体系统难度大。这些都为根肿菌的科学研究带来很大的难度。虽然近些年陆续有许多抗病品种被发现，但还存在局限性，未能成功的大范围普及来对抗根肿病。通过开发药物和土壤连做耕种的方法来防治根肿病也只能够相对减轻植株发病的程度，并不能彻底根除。因此，当前需要研究的主要内容有：（1）进一步了解该病的致病机理，从分子水平彻底杜绝该病的发生；（2）寻找抗病基因，通过培育有效的抗病基因品种来防治该病的发生[19]；（3）筛选高效的抗病或耐病品种[20]。我国现阶段在根肿病的研究和防治方面虽然取得了一定的成果，但没有从根本上彻底消除该病的危害，因此，对抗根肿病的任务任重而道远。

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