响应面法优化苏云金芽孢杆菌产耐热蛋白酶的发酵培养优化

[摘要] 采用二水平Plackett-Burman实验设计对影响发酵培养基的8个成分进行显著性分析，确定最重要的3因素为葡萄糖、酵母膏和ZnSO4；应用响应面分析法对这3个因素进行3水平优化，获得它们的最优组合，得到优化后的最佳发酵培养基配方(g/L)：黄豆饼粉12、酵母膏4.24、葡萄糖5.43、KH2PO4 2、ZnSO4 0.39、MnSO4 0.42。优化后产酶水平达到6473U/mL, 与响应面数学模型的预测值仅有0.49%的误差。

[关键词] 苏云金芽孢杆菌 Plackett-Burman设计 响应面分析法 蛋白酶

0 引言

蛋白酶是一种重要酶制剂，广泛应用于食品工业、生物制药工业、化学洗涤剂工业、皮革工业，具有很高的应用前景和商业价值。耐热蛋白酶又因其具有较强的热稳定性而逐渐被人们重视[1]。本文对筛选到的1株产耐热蛋白酶的苏云金芽孢杆菌FS42的产酶培养基进行优化，采用Plackett-Burman实验设计和响应面分析法（Response Surface Methodology，简称RSM）对发酵培养基进行优化，以快速提高该菌株产酶能力。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)菌株FS42，为本实验室保藏菌种。

1.1.2 培养基

（1）斜面培养基(g/L)：牛肉膏 5g、蛋白胨 10g、琼脂 20g、NaCl 5g 、pH 7.0～7.2；

（2）种子培养基(g/L)：牛肉膏 5g、蛋白胨 10g、琼脂 20g、NaCl 5g 、pH 7.0～7.2；

（3）始发酵培养基(g/L)：黄豆饼粉1.5g、葡萄糖0.5g、酵母膏0.7g、KH2PO4 0.25g、MgSO4•7H2O 0.035g、CaCO3 0.05g, pH为7.0。

1.2 方法

1.2.1 发酵培养方法

由斜面接一环到50mL(250mL的三角瓶）的种子培养基中，于31℃、230 r/min 的恒温摇床培养13h，制成液体菌种，然后按2%的接种量接入到装液量为35mL(250mL的三角瓶)的发酵培养基中，在31℃、230r/min的条件下进行发酵培养。

1.2.2 Plackett-Burman设计优化

采用多因素二水平的Plackett－Burman试验设计方法，对培养基各成分进行显著性筛选，并进行排序，以期获得三个显著性因素，进行响应面设计优化[2,3]。

1.2.3 响应面设计优化

根据响应面分析法的BOX-Behnken设计，对三个显著性因素进行优化，优化三个因素的最佳水平点，获得最佳优化配方，同时验证[2,3]。

1.2.4 蛋白酶活力的测定

采用酪蛋白（SIGMA产品）为底物，采用紫外分光度法进行测定[4]。酶活力单位定义：在pH 7.2、50℃的条件下每1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，定义为1个蛋白酶活力单位（U）。

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman试验设计筛选重要因素

采用Plackett-Burman实验设计对培养基配方各组分（包括：黄豆粉，葡萄糖，酵母膏，K2HPO4 ，ZnSO4•7H2O，MnSO4•H2O，CaCO3，初始pH）进行重要性筛选，确定对产酶影响显著的因素。选择N=12的8因素2水平的Plackett- Burman试验设计，进行培养基优化。以发酵培养基配方的不同组分作为优化输入因子，输入因子X1～X8分别代表黄豆粉，酵母膏，葡萄糖，K2HPO4 ，MnSO4• H2O，ZnSO4•7H2O，MnSO4• H2O，CaCO3，pH，每项均取低(-1)和高(+1)两水平，见表1，响应值Y为蛋白酶的酶活力，表中每列代表每种因素的不同水平。

Plackett-Burman试验的二水平分析目的：在其它因素不变的情况下，分析某因素的变化对响应的影响，从而得出影响培养基组成的主效应因素，结果见表2。结果表明：培养基成分葡萄糖、 酵母膏、初始pH以及ZnSO4•7H2O可信度均大于88.47%，为显著因子，显著性排序为葡萄糖>酵母膏>初始pH>ZnSO4•7H2O。

2.2 响应面BOX-Behnken试验设计优化

2.2.1 试验设计与结果

从一阶试验设计Plackett-Burman试验设计结果获得进入二阶试验设计的三因素：酵母粉、葡萄糖和ZnSO4三个显著因子，将三因素设定三水平(-1,0,1)，各水平设计见表3，试验设计及结果见表4，为三因素三水平15个试验点，实施设计后得到试验数据，进行二次回归拟和，得到交互项和平方项的二次方程，分析因素之间的主效应和交互效应，求得三因素的最佳水平组合[5,6]。由表4可见，试验实测值与模拟值之间误差较小，拟和较好。

2.2.2 二次响应面回归模型的建立

利用SAS统计软件的二次响应面回归（RSREG）进行数据分析，参数估计值见表5，建立得到拟合二次回归方程如下：

方程回归分析及方差分析见表5。回归方程的决定系数 R2=0.9071 ，说明该二次回归方程的拟合程度较好，总模型回归P值为0.038566，说明模型回归显著；方差分析显示，线性回归、二次回归P值小于0.05，均为显著，因此该模型可以用于FS42产耐热蛋白酶发酵优化的理论预测。

2.3 发酵优化最佳配方组合的获得及验证

在获得非线性回归模型和响应面之后，为了求得培养基最佳浓度,对所得的回归拟和方程分别对各自的变量求一阶偏导数，并令其为0得到三元一次方程组，求解此方程组可以得到最大产酶量时的最佳条件[5,6]。即:X1=0.83（5.43g/L），X2= -0.11（4.24g/L），X3=1.33（0.39g/L），Y=6441.51，也即三因素最佳组合为：葡萄糖5.43g/L 、酵母膏4.24g/L、ZnSO4为0.39g/L，此条件下理论预测最大酶活力为6441.51U /mL。

回归模型试验验证：根据此优化组合进行试验验证得到实际酶活力为6473 U/mL，实测值比预测值误差0.49%，可见该模型较好地预测了试验结果，说明应用响应面优化产高温蛋白酶的苏云金芽孢杆菌的液体发酵培养基可行有效。

3 结论

本文对苏云金芽孢杆菌FS42产耐热蛋白酶的液体发酵培养基进行优化。通过Plackett-Burman设计对FS62发酵培养基的8个因素：葡萄糖、酵母膏、KH2PO4 、MnSO4•H2O、ZnSO4•7H2O、CaCO3和初始pH值进行重要性筛选，筛选到3个重要因素，即酵母粉、葡萄糖和ZnSO4。用BOX-Behnken试验设计对它们的配比进行3因素3水平试验设计优化。利用SAS软件进行响应面回归分析得到相应的回归方程，并由此获得最优的浓度配比值，得到优化后的最佳的发酵培养基配方(g/L)为:黄豆饼粉12、酵母膏4.3、葡萄糖5.42、KH2PO4 2、ZnSO4 0.39、MnSO4 0.42。经试验，优化后产酶水平显著提高，达到6473U/mL，与RSM预测值误差仅为0.49%，达到试验预期目标。

参考文献:

[1] 郑毅, 周虓, 黄勤清, 关雄. 产耐温蛋白酶苏云金芽孢杆菌FS140液体发酵条件优化[J]. 应用与环境生物学报, 2007, 13(5):708-712.

[2] 郑毅, 朝科, 张志国. 利用数学统计方法快速优化木聚糖酶液体发酵培养基[J]. 生物数学学报,2008, 23(1):143-150.

[3] 陈宁, 常高峰, 张克旭. L-异亮氨酸发酵培养基的响应面法优化[J]. 食品与发酵工业, 2004, 30(2):33-37.

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[5] 郑毅, 刘源慧, 邓琳芬. 响应面法优化米曲霉α-淀粉酶液体发酵培养基[J]. 海峡科学, 2010(10):3-14.

[6] 刘忠, 杨文博, 孙丹, 白钢, 金永杰. 酶法生产L-半胱氨酸培养基的响应面分析优化[J]. 南开大学学报(自然科学版), 2004, 37(1):83-87.