绵羊体外受精囊胚玻璃化冷冻保存的研究

摘要：以常规的慢速冷冻法为对照，研究了玻璃化冷冻法保存绵羊体外受精囊胚的效果。对于绵羊体外受精囊胚，两种冷冻方法间的囊胚存活率没有明显差异，但玻璃化冷冻组的囊胚孵化率显著高于慢速冷冻法组(分别为76.8%和41.0%，P<0.05)。将冷冻解冻后的绵羊囊胚移植后，玻璃化冷冻组的怀孕率和产羔率明显高于慢速冷冻法的。同时比较了绵羊体外受精囊胚细胞取样后，经不同时间培养后的玻璃化冷冻保存效果。囊胚取样后培养2 h或5 h，胚胎冷冻解冻后的存活率和孵化囊胚率显著高于对照组(分别为75.0%、50.0%，78.8%、69.7%和41.2%、26.5%，P<0.05)。培养10 h后，胚胎冷冻解冻后的存活率和孵化囊胚率有所降低。结果表明，应用玻璃化冷冻法可以较好的冷冻保存绵羊体外受精囊胚及切割取样后的囊胚，绵羊体外受精囊胚切割取样后，经过2～5h时的恢复培养可以提高其抗冻能力。

关键词：绵羊；体外受精囊胚；慢速冷冻；玻璃化冷冻；细胞取样

中图分类号：S826；S814.6 文献标识码：A 文章编号：0439-8114(2008)05-0503-03

Study on Vitrification of Sheep IVF Blastocyst

ZHANG Jia-xin1，2，YANG Mei2，NIU Zhi-hong2，SHI Hong-cai2，GUO Zhi-qin2

(1. Key Lab of Animal Genetics，Breeding and Reproduction，Inner Mongolia Agricultural University，Huhehaote 010018，China；

2. Agricultural Ministry Biotechnology Key Laboratory，Xinjiang Animal Science Academy，Wulumuqi 830000，China)

Abstract：Vitrification and slow freezing of sheep IVF blastocysts were compared in this study. The blastocyst survival rates were similar between vitrification group and slow freezing group，but the hatched blastocyst rates were significantly higher after vitrification compared with slow freezing(76.8% and 41.0% respectively，P<0.05). After embryo transfer，the pregnancy and lambing rates within vitrification group were higher than that of slow freezing group. Vitrification of sheep blastocysts biospied at different intervals were studied. Higher survival rate and hatching blastocyst rate were obtained after culturing 2~5 hours than that of control(75.0%，50.0%，78.8%，69.7% and 41.2%，26.5% respectively，P<0.05). The survival rate and hatched blastocyst rate were decreased after biospied blastocyst culturing 10 hours. In conclusion，sheep IVF blastocysts and biospied blastocysts can be vitrified successfully，and vitrification of biospied blastocysts was improved after culturing 2~5 hours.

Key words：sheep；IVF blastocyst；slow freezing；vitrification；biopsy

动物胚胎的冷冻保存是一项重要的生物技术，它不仅对于低温生物学基础研究具有重要的意义，而且对于生产实践、动物胚胎的商业化应用具有很大的促进作用。与常规的慢速冷冻相比，玻璃化冷冻具有操作简单、冷冻效率高的优点[1，2]。尽管绵羊胚胎的玻璃化冷冻也获得成功[3-5]，但是有关体外受精胚胎的玻璃化冷冻报道却很少，特别是显微操作后的绵羊体外受精胚胎。对胚胎的遗传物质进行早期分析需要取样，主要是从胚胎上取下一些细胞用于检测。取样过程对新鲜胚胎的活力没有影响，但是取样后的胚胎冷冻解冻后的发育能力却下降[6]。我们以慢速冷冻为对照，研究了绵羊体外受精囊胚的玻璃化冷冻保存效果及其解冻后的移植效果，同时比较了绵羊体外受精囊胚细胞显微取样后，经不同时间培养后的玻璃化冷冻保存效果。从而为绵羊体外受精胚胎的相关研究和应用提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 卵母细胞的收集、体外成熟

从屠宰场刚宰杀的绵羊体内剪下卵巢，在3h内运回实验室。在超净工作台内，从卵巢表面上直径为2～5 mm的卵泡中抽取卵母细胞，在显微镜下挑选出含有完整卵丘细胞层、胞质均匀的卵母细胞。将选出的卵母细胞用成熟液洗3次，然后将15枚卵母细胞放入50 μL的成熟液滴中，在38.6℃，5%CO2，饱和湿度的培养箱中培养24～26 h。成熟液组成为TCM1999(Sigma)+10%FBS(Hyclone)+3.6 μg·mL^-1 FSH(中国科学院动物所)+6 μg·mL^-1 LH(中科院动物所)+1 μg·mL^-1雌二醇(Sigma)。

1.2 体外受精

在超净工作台中剖开新鲜的睾丸，将附睾尾部剪碎，把碎片放入受精基础液SOFM，在39℃的温箱中悬浮30～50 min，然后移入10mL试管中。用SOFM将精子悬浮液离心洗涤两次(5 min，1 500 r·min^-1)，然后用受精液(SOFM+20%绵羊血清)重悬浮精子，并在38.6℃下孵育30 min。同时，将成熟的卵母细胞在0.05%的透明质酸酶(Sigma)液中反复吹打冲洗一次，除去部分卵丘细胞，保留2～3层卵丘细胞。用受精液将卵母细胞洗涤3次后将15～20枚成熟卵母细胞放入50 μL受精液中，加入孵育后的精子至5×106精子·mL^-1，并放入CO2培养箱中培养。

1.3 受精卵的体外培养

精卵共培养20 h后，将受精卵用培养液洗涤3次，并用吸管反复吹吸，去除吸附的多余精子后，将10～15枚受精卵移入50 μL培养液滴中。培养液为SOFM+1%NEAA(Gibco)+1%EAA(Gibco)+1mmol 谷氨酰胺(Sigma)+5 U·mL^-1胰岛素(Sigma)+3

mg·mL^-1BSA(Sigma)。受精后48 h将受精卵移入含有10%犊牛血清的培养液中。每隔48 h换2/3培养液，换液时观察胚胎发育情况。在体外受精后第7天检查各试验组胚胎发育情况。

1.4 胚胎取样

胚胎用操作液洗涤两次后，移入20 μL的操作液滴，操作液是添加了7.5 μg·mL^-1细胞松弛素B的无钙、镁离子的SOFM液。在显微操作仪上用吸管从胚胎上吸取7～8个细胞，取样后，胚胎用培养液洗涤3次后，移入培养液滴中，按试验设计在CO2培养箱中培养不同时间后冷冻保存。

1.5 胚胎冷冻

慢速冷冻：以DPBS为基础液，添加3 mg·mL^-1 BSA、1.8 mol乙二醇、0.05 mol海藻糖组成。在室温(25℃)下，将胚胎置于冷冻液中平衡5 min后装入0.25 mL的细管，将细管放入冷冻仪。然后启动冷冻程序，从0℃以1℃·min^-1降到-6.7℃，置冰后平衡10 min。然后以0.3℃·min^-1降到-30℃，再直接投入液氮保存。解冻时，将细管从液氮中取出，在空气中停留5 s，然后放入37℃水浴10 s，随后将胚胎移入培养液中，胚胎用培养液洗涤3次后，在培养液滴中继续培养48 h并观察胚胎发育情况。

玻璃化冷冻：所有玻璃化冷冻液的基础液是DPBS添加0.3 mmol的丙酮酸钠和3.3 mmol葡萄糖。在室温下(25℃)，将胚胎移入平衡液1(基础液+10%血清+10%甘油)中平衡5 min，然后在平衡液2(基础液+10%血清+10%甘油+20%乙二醇)中平衡5 min，然后将胚胎直接移入玻璃化液(VS，基础液+10%血清+25%甘油+25%乙二醇)中，并投入液氮。

解冻时，从液氮中取出细管，在37℃水浴中解冻10 s，将细管中的胚胎排入0.5 mol蔗糖液中，迅速拣出胚胎，并移入0.25 mol蔗糖液中平衡5 min，把胚胎用培养液洗涤3次，培养2 h并观察胚胎恢复发育情况。

1.6 受体羊处理及胚胎移植

受体母羊进行同期化处理，母羊阴道埋植孕酮海绵栓12 d，在撤栓前每只羊肌肉注射2支氯前列烯醇，同时注射400国际单位PMSG。此后每天用试情公羊早晚各试情一次直至发情。发情后第7天，将受体羊麻醉，固定于手术架上，在腹中线切一个小口，将子宫取出，在有黄体一侧的子宫角用钝针头插一个小孔，将2枚胚胎移入子宫角。45d后用B超检查怀孕情况。

1.7 统计分析

所有试验重复3次，获得的数据均用卡平方(χ2)检验并进行统计分析，P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

从表1可知，绵羊体外受精囊胚冷冻解冻后，慢速冷冻法和玻璃化冷冻法两组间的囊胚存活率没有显著差异(分别为85.4%和83.3%，P>0.05)，但玻璃化冷冻法组的孵化囊胚率明显高于慢速冷冻法组(76.8%和41.0%，P<0.05)。从表2可知，玻璃化冷冻解冻后的绵羊体外受精囊胚，移植后的怀孕率和产羔率明显高于慢速冷冻组的(P<0.05，分别为52.3%、34.1%和27.8%、11.1%)。从表3可知，绵羊体外受精囊胚取样后，培养2 h或5 h，胚胎冷冻解冻后的存活率和孵化囊胚率显著高于对照组(分别为75.0%、50.0%、78.8%、69.7%和41.2%、26.5%，P<0.05)。培养10 h后，胚胎冷冻解冻后的存活率和孵化囊胚率有所降低，但差异不显著。

3 小结与讨论

玻璃化冷冻是指利用物理学原理将高浓度的冷冻保护剂急速降温后，由液态转化为外形类似玻璃状的稳定而透明的非晶体化固体状态[1]。玻璃化状态可以抑制冰晶的形成，有报道表明，玻璃化冷冻可以减少低温对胚胎的损害，例如对细胞内脂滴和细胞膜的破坏，以及细胞骨架的损伤，从而提高胚胎冷冻后的存活能力[7]。

体外受精胚胎含有高比例的脂类，这使得体外受精胚胎对低温的影响更加敏感[8]。目前，慢速冷冻法仍然是国际上常用的胚胎冷冻方法。但是，在慢速冷冻过程中，由于降温速度比较慢，从而导致胚胎内更容易形成冰晶，这对于脂类含量高的体外受精胚胎则损害增加。玻璃化冷冻采用高浓度的冷冻剂和快速的降温速度，在一定程度上避免了冰晶的形成以及由此而造成的对体外受精胚胎的损害。本试验的结果表明，绵羊体外受精囊胚用玻璃化冷冻法冷冻保存后，其存活的囊胚孵化率、移植后怀孕率以及产仔率都明显高于慢速冷冻法的。与慢速冷冻相比，玻璃化冷冻法更适合绵羊体外受精胚胎的冷冻保存，这与已报道的牛的结果相似[7，9]。

目前主要有两种方法用于胚胎取样，一种是用刀片将胚胎的一部分细胞和透明带切下[10]；另一种是用吸管在透明带下吸取一部分胚胎细胞[11]。前者方法简单，但是易对胚胎造成损伤；相反胚胎透明带下吸取的方法对胚胎的损伤较小。对于牛胚胎，在胚胎上穿孔后，利用玻璃吸管从胚胎上吸取一些细胞后要比刀片切割后获得较高的怀孕率[11]。我们的结果表明，绵羊体外受精囊胚取样后，经过一段时间培养(2～5 h)，可以明显提高其对冷冻解冻过程的抵抗力，但是过长时间培养会降低胚胎冷冻解冻后的存活率。这与以前的有关报道结果相似，冷冻前过长时间的培养会导致牛半胚对冷冻的抵抗力下降[11，12]。

总之，应用玻璃化冷冻液可以较好地得到冷冻保存绵羊体外受精囊胚及切割取样后的囊胚，绵羊体外受精囊胚切割取样后，经过2～5 h的恢复培养可以提高其抗冻能力。

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(责任编辑 王 珞)