响应面法优化野菊花中绿原酸的提取工艺

摘要：以野菊花为原料，研究绿原酸最佳提取工艺条件。在乙醇浓度、液固比、提取时间等单因素试验的基础上，根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，应用响应面分析法对野菊花中绿原酸提取工艺进行优化。结果表明，超声波辅助提取野菊花中绿原酸的最佳工艺条件为：乙醇浓度80%、液固比26mL∶1g、提取时间35min。在该条件下，绿原酸实际提取率达2.32%，与模型预测值（2.35%）接近。

关键词：野菊花；绿原酸；超声波提取；响应曲面法

中图分类号：R284.2文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2014）11-0327-03

野菊花（Chrysanthemumindicum）别称山菊花、甘菊花，为菊科多年生草本植物，外形与菊花相似，野生于山坡草地、田边路旁，具有疏风清热、消肿散热、抗菌消炎、降血压等多种药理作用[1-2]。绿原酸是菊花中的一种重要成分，属酚类化合物，具有抗菌、降压、降脂、抗病毒、抗肿瘤、保肝利胆、促进肠道蠕动、清除自由基、兴奋中枢神经系统等多种生物活性，是菊科植物中的主要药理成分之一[3-6]。目前，绿原酸提取工艺主要有水浴提取法、乙醇回流法、超声提取法、微波提取法、超临界流体萃取法等[7-10]。本试验采用超声波辅助提取野菊花中绿原酸，并用响应面试验法对其提取工艺进行优化，为工业化提取野菊花中绿原酸提供了参考。

1材料与方法

1.1仪器与试剂

AUY120电子天平（日本岛津）；UV2450紫外分光光度计（日本岛津）；KQ-200KDB高功率速控超声清洗器（江苏省昆山市超声仪器有限公司）；RE-52A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器设备有限公司）；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（河南郑州长城科工贸有限公司）。

野菊花购于南京中药材市场，去除苞片后35℃干燥，粉碎，过40目筛，备用。绿原酸标准品（中国药品生物制品检定所），无水乙醇（分析纯），试验用水均为二次蒸馏水。

1.2试验方法

1.2.1绿原酸的提取工艺

准确称取2g干燥的野菊花粉末于烧杯中，加入80%乙醇溶液，在超声清洗器中超声提取，设置一定的超声温度、超声功率、超声时间，提取一定次数后过滤。滤液在旋转蒸发仪中浓缩，定容至50mL，得到绿原酸提取液，测定其吸光度，分析绿原酸含量，计算绿原酸提取率。

1.2.2绿原酸含量的测定

准确称取绿原酸标准品，用乙醇配制成浓度为0.1mg/mL的储备液。分别吸取上述溶液0.10、0.30、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50mL于10mL容量瓶中，定容摇匀。以乙醇为参照，在绿原酸的最大吸收波长327nm下依次测定吸光度。以绿原酸浓度C为横坐标、吸光度D为纵坐标进行回归分析，绘制标准曲线，标准曲线方程为D=41.757C+0.0387，相关系数r=0.9991，可见绿原酸浓度在0.001～0.025mg/mL范围内与吸光度D呈良好的线性关系。将提取的绿原酸稀释一定倍数，再在327nm下测定吸光度，根据标准曲线及公式（1）计算绿原酸的提取率（y）：

式中：C表示绿原酸浓度，mg/mL；V表示体积，L；n表示稀释倍数；m表示野菊花粉末的质量，g。

1.2.3单因素试验分别以乙醇浓度、液固比、超声时间、超声温度、超声功率等为因素，考察各因素对绿原酸提取率的影响。

1.2.4响应面试验设计

在单因素试验的基础上，选择乙醇浓度、液固比、提取时间3个因素作为考察对象，以绿原酸提取率为响应值，采用DsignExpert7.0统计分析软件中的Box-behnken中心组合试验设计，对提取条件进行优化。具体试验因素水平及编码见表1。

2结果与分析

2.1单因素试验

2.1.1乙醇浓度对绿原酸提取率的影响

由图1可知，随乙醇浓度的增加，绿原酸提取率先迅速增加后降低。当乙醇浓

度为80%时，提取率最高，达1.66%；此后乙醇浓度再增加，提取率降低。说明野菊花中绿原酸在浓度为80%的乙醇中溶解度最大，因此乙醇浓度选择80%。

2.1.2液固比对绿原酸提取率的影响

由图2可知，绿原酸提取率随液固比的增加而上升。当液固比为26mL∶1g时，提取率最高，为2.31%；此后再增加液固比，提取率反而下降，也会给后序工艺带来困难，因此最终确定液固比为26mL∶1g。

2.1.3超声时间对绿原酸提取率的影响

由图3所示，超声10～30min时，随着超声时间的增加，绿原酸提取率呈上升趋势，至超声30min时，提取率最高；当超声时间在30～50min时，提取率趋于稳定不再发生变化；此后，超声时间增加到60min，因提取时间太长，绿原酸分解，提取率反而减小。所以提取时间宜选择30min。

2.1.4提取温度对绿原酸提取率的影响

从图4可以看出，随着提取温度的增加，绿原酸提取率增加。当提取温度达35℃时，提取率最高，为2.47%；此后再提高超声温度，提取率反而下降，可能是由于温度过高导致绿原酸发生分解[11]。因此，提取温度宜选择35℃。

2.1.5超声功率对绿原酸提取率的影响

由图5可知，绿原酸的提取率随着超声功率的增加显著上升，当超声功率达200W时，提取率最高，为1.35%。由此可见，超声功率越高，绿原酸析出越充分，因此超声功率选择200W。

2.1.6提取次数对绿原酸提取率的影响

由图6可知，随着提取次数的增加，绿原酸提取率逐渐减小。当提取1次时，提取率最高，为2.99%；另外从提取成本考虑，宜选择提取1次。

2.2响应面试验优化绿原酸提取工艺

2.2.1绿原酸提取试验方案及方差分析

根据Box-behnken中心组合试验设计原理，综合单因素试验结果，选取乙醇浓度、液固比和超声时间3个对绿原酸提取率影响较大的因素，对提取工艺条件进行响应面试验优化。试验结果见表2，回归模型的方差分析见表3。

3个因素经拟合得到绿原酸提取率回归方程：y=2.34+0.021A+0.023B+0.086C+0.095AB+0.022AC+0.025BC-0.25A2-0.25B2-0.25C2。表3显示，方程的R2为0.9986，说明该模型达极显著水平（P<0.0001），失拟项在0.10水平上不显著（P>0.10）。R2Adj为0.9967，说明建立的模型能够解释99.67%响应值的变化，可见回归方程拟合度和可信度均很高，试验误差较小。

根据回归方程作响应面图，考察所拟合的响应面形状，分析各提取条件对绿原酸提取率的影响，响应面图如图7所示，3组图直观地反映了乙醇浓度、液固比、超声时间3个因素对响应值的影响。结合回归方程及图7可以看出，各试验因素对提取率的影响不是简单的线性影响。各因素对提取率影响

程度从强到弱依次为提取时间>液固比>乙醇浓度，其中提取时间对提取率的影响极显著（P<0.0001）。

2.2.2模型的优化和验证

为检验试验结果的可靠性，进一步确定最佳工艺条件，通过软件求解方程得最佳提取工艺条件为：乙醇浓度80.317%，液固比26.26mL∶1g，超声时间35.80min，此时绿原酸提取率可达2.35%。为检验结果的可靠性，考虑到实际操作的便利，将最佳工艺条件修正为：乙醇浓度80%、液固比26mL∶1g、超声时间35min进行提取试验，实际测得绿原酸提取率为2.32%，与预测值基本接近，证明响应曲面法优化菊花中绿原酸提取工艺参数的可行性。

3结论

本研究在单因素试验基础上，利用DesignExpert7.0设计软件优化野菊花中绿原酸的提取工艺。根据回归方程得到绿原酸的最佳提取工艺为：乙醇浓度80%，液固比26mL∶1g，提取时间35min。在此條件下，绿原酸的的提取率为2.32%，与理论值（2.35%）基本一致，说明该模型能很好地预测绿原酸提取条件与提取率之间的关系。

参考文献：[HJ1.45mm]

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