响应面法优化超声辅助提取山麦冬多糖工艺

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摘要：采用响应面法优化山麦冬[Liriope spicata （Thunb.） Lour.]多糖超声波辅助提取工艺。在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken设计研究超声时间、液料比和超声功率3个因素对山麦冬多糖提取得率的影响，得出的最佳提取条件为超声时间40 min，液料比31∶1（mL∶g），超声功率360 W，在此条件下山麦冬多糖的提取率为4.33%。

关键词：山麦冬[Liriope spicata （Thunb.） Lour.]；多糖；超声波辅助提取；响应面法

中图分类号：Q539；S567.23+2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）13-3446-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.13.044

山麦冬[Liriope spicata （Thunb.） Lour.]为多年生常绿草本植物，其干燥块根可以入药，性味甘、微苦、微寒，具有养阴生津、润肺清心的功效，可用于治疗肺燥干咳、虚劳咳嗽、津伤口渴、心烦失眠、肠燥便秘等病症[1-4]。山麦冬中含有多种皂苷类、有机酸类化学成分，其主要活性成分山麦冬多糖具有降血糖、延缓衰老、抗疲劳、辅助抑制肿瘤、抗辐射等作用[5-7]。

目前，大多数中药材中多糖的提取采用直接水提法[8]或有机溶剂脱脂水提法[9]，这些传统方法耗时长，产品不容易纯化。超声波法能够提高细胞释放多糖的速度、缩短提取时间、提高多糖提取率，避免了传统提取方法的缺点，能有效提高多糖的提取率，在植物多糖的提取中被广泛采用[10，11]。本试验主要采用乙醇加热回流除去山麦冬粉末中单糖、低聚糖等成分，沉淀干燥后加水超声辅助提取多糖，采用苯酚-硫酸比色法测定多糖含量，响应面法优选提取工艺，为山麦冬多糖的研究开发及工业化生产提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

山麦冬购于河南省南阳市仲景药材市场，产地为湖北襄阳；乙醇、浓硫酸、重蒸苯酚、葡萄糖等均为国产分析纯。KQ-500VDE型双频数控超声波清洗机，昆山市超声仪器有限公司；LD-100型实验室用小型粉碎机，长沙市常虹制药机械设备厂；UV-2000型可见分光光度计，尤尼柯上海仪器有限公司；TDL-5-A型台式离心机，上海安亭科学仪器厂；PHG-9240A型电热恒温干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；DZKW-4型双列六孔电子恒温水浴锅，北京中兴伟业仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 多糖提取 原料预处理：将山麦冬切碎、烘干，粉碎过100目筛，采用95%乙醇回流处理，将沉淀晾干得到山麦冬粉末。

多糖提取：称取一定量预处理的山麦冬粉末，依照试验设置的超声波功率及超声时间，用一定体积的去离子水浸提，离心，上清液即多糖提取液。

1.2.2 多糖含量的测定 山麦冬多糖含量的测定采用苯酚-硫酸比色法[12]，以葡萄糖为标准品。按操作规程绘制标准曲线方程Y=13.467X-0.002 8，R2=0.999 4，其中X为葡萄糖含量（mg/mL），Y为吸光度。说明浓度范围在0～0.1 mg/mL，线性关系良好。

多糖的精制：将多糖提取液浓缩至提取液总体积的1/3左右时用3倍体积的乙醇沉淀，离心，沉淀分别用乙醇、丙酮洗涤各2次，烘干，得到灰白色粉末即山麦冬多糖。

换算因子的测定：精密称取山麦冬多糖20.00 mg，置于100 mL容量瓶中，用去离子水溶解稀释至刻度并摇匀，精密吸取10 mL，稀释至100 mL，取2.0 mL置于试管中，按标准曲线的方法测定多糖溶液中的葡萄糖含量，按以下公式计算山麦冬多糖换算因子，得到f=1.253。

f=W/CD

式中，W为山麦冬多糖质量（mg）；C为山麦冬多糖中葡萄糖含量（mg/mL）；D为山麦冬多糖稀释倍数。

山麦冬多糖提取率：多糖提取液用去离子水稀释到一定浓度，采用标准曲线的方法测定溶液中葡萄糖含量，按以下公式计算多糖提取率。

多糖提取率=CDVf/m×100%

式中，C为供试溶液中葡萄糖含量（mg/mL）；D为供试溶液稀释倍数；V为溶液体积（mL）；m为预处理的山麦冬粉末质量（mg）；f为换算因子。

1.2.3 单因素试验 称取2.0 g预处理后的山麦冬粉末若干份，分别以不同的超声时间、液料比和超声功率为考察因素，对山麦冬多糖进行超声提取，计算多糖提取率，研究各因素对多糖提取率的影响。

1）超声时间对山麦冬多糖提取率的影响。取预处理的山麦冬粉末2.0 g，加水60 mL（液料比30∶1，mL∶g，下同），在300 W的功率下，考察超声提取10、20、30、40、50、60、70 min对山麦冬多糖提取率的影响。

2）超声功率对山麦冬多糖提取率的影响。分别称取预处理的山麦冬粉末2.0 g，液料比30∶1，超声提取时间20 min，考察超声功率分别为200、250、300、350、400、450、500 W时对山麦冬多糖提取率的影响。

3）超声功率对山麦冬多糖提取率的影响。固定超声功率为300 W，超声提取时间为20 min，分别称取预处理的山麦冬粉末2.0 g，考察液料比为10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1对山麦冬多糖提取率的影响。

1.2.4 响应面试验设计 在单因素试验的基础上，根据响应面分析软件Design Expert V 8.05b中的设计组合，以多糖提取率为响应值，以超声波功率、液料比、超声时间为因素，进行3因素3水平的响应面试验（表1），优化山麦冬多糖的超声辅助提取条件。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 超声时间对山麦冬多糖提取率的影响 如图1所示，山麦冬多糖提取率随着超声时间的延长呈先增加后降低的趋势，当超声时间达到30 min时多糖提取率增加缓慢，超过40 min时，多糖提取率下降，分析原因可能是时间过长对多糖结构造成破坏，影响提取率[13]，故选取30 min为适宜超声时间。

2.1.2 超声功率对山麦冬多糖提取率的影响 如图2所示，随着超声功率的增大，多糖提取率呈先增加后降低的趋势，在超声功率350 W时提取率最高，原因是功率增大，超声作用增强，细胞破碎充分，有助于多糖的溶出，但功率过大时，可能导致局部温度过高破坏多糖的结构，提取率下降[14]，故选择350 W为适宜的超声功率。

2.1.3 液料比对山麦冬多糖提取率的影响 如图3所示，开始随着液料比的增加，山麦冬多糖提取率有明显的升高，说明液料比的增加降低了溶液黏度，有利于传质扩散，在液料比30∶1时多糖提取率达到最高，故选择30∶1为适宜液料比。

2.2 响应面法优化多糖的提取工艺

2.2.1 响应面试验结果 中心组合试验方案及结果见表2。利用Design-Expert V 8.05b软件对表2中数据进行二次多元回归拟合，得到多糖提取率Y与X1、X2、X3之间的二次回归方程为Y=4.23+0.3X1+0.16X2+0.13X3-0.055X1X2+0.75X1X3-0.01X2X3-0.27X12-0.31X22-0.41X32。

对表2中的试验结果进行统计分析，所得方差分析结果见表3。结果表明，该模型极显著（P<0.01），其中R2=0.987 5，表明模型响应值变化的98.75%来自考察的变量。回归方程失拟项P=0.079 0>0.05，失拟性检验结果不显著，表明模型的纯误差不显著，其因变量和自变量之间的回归关系显著[15，16]。由F值可知，各因素对多糖提取率的影响大小顺序为X1>X2>X3，且X1、X2、X3对多糖提取率的影响极显著，二次项对多糖提取率的影响极显著，交互项对多糖提取率的影响不显著。

2.2.2 响应面分析 图4、图5、图6为两因素间的交互作用响应面分析图，均表现为曲线较为平缓，说明两因素之间交互作用影响不显著。由试验和分析数据预测，超声辅助提取山麦冬多糖的最佳条件是超声时间39.5 min，液料比31.05∶1，超声功率360.5 W，此条件下多糖得率为4.35%，由于预处理时粉末过100目筛，多糖容易析出，故提取率较高。

2.2.3 验证试验 按照优化工艺条件，结合实际应用，将最佳提取条件参数修正为超声时间40 min，液料比31∶1，超声功率360 W。经5次平行验证试验，得到山麦冬多糖提取率分别为4.32%、4.32%、4.35%、4.32%、4.33%，平均值为4.33%，相对标准偏差（RSD）为1.63，与理论预测值4.35%的相对误差为0.02个百分点。表明试验值与回归模型所预测的理论值相符合，进一步验证了该模型的可靠性。

3 小结

本试验采用超声波辅助提取山麦冬多糖，通过单因素分析结合响应面优化的方法，建立了以山麦冬多糖提取率为目标值，以液料比、超声时间、超声功率为因素的山麦冬多糖超声辅助提取工艺的二次多项式回归数学模型，模型拟合度良好。模型的方差分析表明，各因素对麦冬多糖超声提取影响的大小顺序为超声时间、液料比、超声功率。最终确定麦冬多糖超声辅助提取最佳工艺条件为超声时间40 min，液料比31∶1，超声功率360 W。该条件下山麦冬多糖的提取率为4.33%。

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