金银花中绿原酸提取工艺研究

摘 要：通过设计正交试验，以HPLC法检测的绿原酸含量为考察指标，对样品颗粒大小、提取溶剂、超声波处理时间和提取次数进行提取工艺优化。结果为样品颗粒过60目筛，50%甲醇为溶剂，40 ℃水浴超声处理20 min时，金银花中绿原酸提取量最高，为17.015 mg/g，重复提取2次时绿原酸提取率为95.57%。该方法简单、快速、准确，可用于金银花中绿原酸的提取。

关键词：金银花  绿原酸  提取工艺  高效液相色谱法

中图分类号：R282.2 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2014）11（b）-0042-02

金银花为忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥花蕾或带初开的花，具有清热解毒、平肝明目、和抗菌、降压等功效[1]，其主要活性成分之一绿原酸作为金银花中酚酸类化合物，具有抗菌、抗炎、抗内毒素、抗氧化、降血脂、血糖等多种作用[2-3]，在医药、食品和日用化工领域具有广泛的应用价值。绿原酸含量被用作评价金银花质量的指标，因此，建立简单、快速和准确的绿原酸提取工艺成为检测金银花质量的前提。该文尝试采用高效液相色谱法测定绿原酸的含量，超声波辅助法对样品颗粒大小、超声波处理时间、提取溶剂和提取次数等因素进行考查，以确定金银花中绿原酸的最佳提取工艺，为金银花质量标准的进一步完善提供参考。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪（UltiMate3000，戴安），ULUP-Ⅳ优普超纯水制造系统（四川优普），等。乙腈为色谱纯（ThermoFisher），金银花购自信阳市美锐大药房。对照品绿原酸（上海同田，批号：327-97-9）。

2 方法与结果

2.1 供试品制备工艺研究

该文对绿原酸提取过程中的颗粒大小（A），甲醇体积分数（B），超声波处理时间（C）和抽提次数（D）等4个主要因素分别进行了3个水平正交试验设计。

由表1极差分析可知，当以绿原酸的提取量为检测指标时，各因素的影响大小依次为B>D>C>A，即提取溶剂（B）对绿原酸的提取效果影响最为显著，表现为，水平2>水平3>水平1，为主要因素，应取最好水平;样品提取次数（D）对绿原酸提取量的影响仅次于提取溶剂，而样品颗粒大小和超声波处理时间，为次要因素。然而，由同一因素不同水平下绿原酸的平均提取量k值的大小可知，在A因素中，随着样品颗粒的变小，绿原酸提取量在样品过60目筛时最好;在C因素中，随着超声处理时间的增加，绿原酸的提取量呈增加趋势，而水平1和水平2对未表现出明显差异;在D因素中，随提取次数的增加绿原酸的提取效果表现为水平3>水平2>水平1，而水平2和水平3差异不大。因此，考虑到操作时间和成本等原因，各因素的最佳搭配为A2B2C3D2。此方案与正交表中的序号为5的条件比较接近，通过补做试验得到绿原酸的平均提取量为17.015 mg/g（表2），比方案5中绿原酸提取量（14.892 mg/g）提高了14.26%，这说明方案A2B2C3D2可作为金银花中绿原酸提取工艺的理想选择。

综合正交试验验和补做的单因素试验结果，金银花中绿原酸的最佳提取方案为：样品干燥后研磨成颗粒（60目）1.0 g，加入20 mL 50%甲醇溶液，40 ℃水浴超声处理20 min，然后10，000 r/min离心5 min，分离液体和组织块，将液体转移至新的容器中;再用20 mL 50%甲醇溶液悬浮组织块，40 ℃水浴超声处理10 min，合并液体部分;利用旋转蒸发仪将合并的液体浓缩，定容10 mL 50%甲醇溶液中，待用。

2.2 色谱条件

该文中所有色谱试验均采用高效液相色谱DIONEX UltiMate­­ 3000 （Thermo Scientific，U.S.）系统进行。数据分析采用变色龙分析软件（revision 6.8， Thermo Scientific，U.S.）。色谱柱：C18柱（Acclaim，250 mm×4.6 mm， 5 μm， Thermo Scientific，U.S.）;流动相为乙腈-0.01%磷酸水溶液（12：88）;流速为1.0 mL/min;柱温为30 ℃;检测波长为310 nm;进样量为20 µL。

2.3 对照品溶液的制备

取绿原酸对照品10 mg，置于50 mL容量瓶中，加入50%甲醇溶液并定容至50 mL，摇匀并进行超声处理，待药品完全溶解后即得200 µg/mL的绿原酸对照品储备液，放入冰箱（4 ℃）待用。

2.4 标准曲线的绘制

将5个浓度梯度的对照品溶液（100、50、25、12.5、6.25 µg/mL），按上述色谱条件进行检测，变色龙软件自动以峰面积为纵坐标，绿原酸检测浓度（µg/mL）为横坐标，绘制标准曲线并进行回归计算，回归方程为：Y=0.7495X-1.0041，R2=0.9996，结果表明绿原酸在6.25～100 µg/mL范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验

取绿原酸对照品溶液（50 µg/mL），连续进样6次，按“2.2”项下色谱条件测定，结果绿原酸峰面积的RSD为0.21%。

2.6 重复性试验

取同一批金银花粉末6份，依照优化后的方案进行处理，并计算绿原酸的含量。结果绿原酸峰面积的RSD为0.73%。

2.7 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于样品制备后0、3、6、9、12 h进行测定，结果绿原酸峰面积的RSD为0.49%，结果表明供试品溶液在12 h内保持稳定。

2.8 加样回收率试验

准确称取金银花粉末0.2 g，共12份，其中6份分别加入绿原酸对照品200 µg，再按优化方案制备供试品溶液，经HPLC测得绿原酸的平均回收率为100.75%，RSD为1.62%，结果表明该方法准确。

2.9 样品测定结果

精确称取0.2 g金银花样品，共9份，每种提取液3个重复，并按照最佳提取条件对其中的绿原酸进行提取。由HPLC检测结果（表2）可以看出，在第一次提取液中，热水中绿原酸的提取量分别仅为甲醇提取液中的25.28%和为50%甲醇提取液中的32.61%;在第二次提取液中，甲醇中绿原酸提取量为2.290 mg/g，显著高于热水中绿原酸提取量（0.756 mg/g）和50%甲醇中绿原酸提取量（0.907 mg/g）;而第三次提取液中，3种提取液中的绿原酸含量都比较低。总之，50%甲醇作为提取溶剂时，绿原酸提取量最高，平均为17.015 mg/g，甲醇次之，为14.815 mg/g。

3 结语

本研究得出体积分数为50%的甲醇溶液作为金银花中绿原酸的提取溶剂时，绿原酸提取量显著高于热水，而且非目标物质的峰面积较小，有利于绿原酸的进一步纯化。3种提取溶剂均可在完成2次抽提时获得95%以上的绿原酸，因此，为了减少提取液浓缩过程中的能耗和提高工作效率，可以只选择2次提取操作。

样品颗粒大小和超声波处理时间直接影响到物质的溶出效果，但是颗粒过小则会增加样品的处理难度，绿原酸得率与超声波处理时间关系不显著，反而延长处理时间会增大提取溶液粘度，尤其是热水作为提取溶剂时。

总之，金银花样品干燥至恒重后，研磨，颗粒过60目筛，50%甲醇为溶剂，40 ℃水浴超声处理20 min时，绿原酸得率高、重复性好。本提取工艺操作简便、快速、准确，可以为金银花质量监控提供一定的技术支持。

参考文献

[1] 中国药典委员会.中国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2010：295.

[2] 雷玲，李兴平，白筱璐，等.金银花抗内毒素、解热、抗炎作用研究[J].中药药理与临床，2012，28（1）：115-117.

[3] Hebeda CB，Bolonheis SM，Nakasato A，et al.Effects of chlorogenic acid on neutrophil locomotion functions in response to inflammatory stimulus[J].J Ethnopharmacology，2011，135（2）： 261-269.