一株马铃薯黑痣病生防菌的筛选及发酵条件优化

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摘要 采用平板对峙法从土壤中筛选并鉴定一株马铃薯黑痣病的生防菌，并对该菌株发酵培养基和发酵条件进行了优化。结果显示，H13菌株的最优培养基组成：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化钠10 g/L，葡萄糖8 g/L，蔗糖6 g/L，干酪素6 g/L，硫酸镁1 g/L;最佳培养条件为初始pH 7.2，发酵时间35 h，接种量300 μL种子液，转速180 r/min，发酵温度28 ℃。

关键词 生防菌;发酵条件;培养基

中图分类号 S 435.42文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）23-0153-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.23.044

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Screening of an Antagonistic Strain of Potato Black Nevoid Disease and Optimization of Fermentation Conditions

CHENG Yong le，LU Xiao pei，JIANG Ying et al

（College of Life Sciences， Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot， Inner Mongolia 010018）

Abstract A biocontrol strain of potato black nevoid disease was screened and identified by plate confrontation method， and the fermentation medium and fermentation conditions of the strain were optimized. The results showed that the optimum culture medium of strain H13 was tryptone 10 g/L， yeast extract 5 g/L， sodium chloride 10 g/L， glucose 8 g/L， sucrose 6 g/L， casein 6 g/L， magnesium sulfate 1 g/L. The optimum culture conditions were as follow： the initial pH value of 7.2， the fermentation time of 35 h， the inoculum size of 300 μL seed solution， the rotating speed of 180 r/min， and the fermentation temperature of 28 ℃.

Key words Biocontrol bacteria; Fermentation conditions;Culture medium

马铃薯黑痣病是由立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）引起的一种土传性真菌病害，该病害既可通过土壤传播，也可通过带病种薯传播[1]，在世界各国马铃薯主产区均普遍发生，严重影响马铃薯的产量和品质[2]。目前，马铃薯黑痣病主要以化学防治为主，但化学农药污染环境，破坏生态，对食品安全产生了严重影响，因此筛选马铃薯土传病的生防菌防治马铃薯黑痣病是有效途径之一，且生防菌对生态、人类健康和环境安全[3]。笔者采用平板对峙法从土壤中筛选并鉴定一株马铃薯黑痣病的生防菌，并对该菌株发酵培养基和发酵条件进行了优化。

1 材料与方法

1.1 菌株的分离与鉴定

利用分离芽孢杆菌的方法[4]分离菌株，用平板对峙法筛选具有拮抗效果的菌株，参考文献[5]扩增16S rRNA基因，PCR产物送至北京博迈德生物有限公司进行测序。

1.2 初始发酵培养基的筛选

选择5种不同的发酵培养基，分别是1/2 R2A培养基、MS培养基、马丁培养基、高氏一号培养基、LB培养基，接种200 μL H13种子液，在28 ℃、160 r/min条件下培养40 h，测定发酵液的OD600，每种发酵培养基3次重复。

1.3 碳源、氮源、无机盐的确定

分别加入浓度为0.2%、04%、0.6%、0.8%、1.0%的麦芽糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、葡萄糖、蛋白胨、干酪素、硫酸铵和磷酸氢二胺接种至50/100 mL三角瓶，加入浓度为0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%硫酸镁、碳酸钙和磷酸氢二钾接种至50/100 mL三角瓶，确定最优碳源、氮源、无机盐。

1.4 发酵培养基的优化

将筛选后得到的最佳碳源、氮源、无机盐3个重要的培养因素按照正交试验[6-8]L9（34）设计，pH为7.0，在28 ℃、160 r/min振荡培养40 h，以OD600作为指标考察4因素3水平对发酵培养基的影响，从而确定最佳培养基配方。

1.5 发酵条件的优化

以优化的培养基为发酵培养基，分别测定不同发酵时间初始pH（4.3、5.5、5.8、7.2、7.7、8.0、86和9.2）、發酵温度（20、25、28、30、35、40 ℃）、发酵时间（10、20、30、40、50、60、70 h）、摇床转速（150、160、180、210、230 r/min）、初始接种量（50、100、150、200、250、300、350 μL），对H13菌株OD600的影响，以初始条件为基础，每一因素的优化均在前一因素优化的基础上进行。

2 结果与分析

2.1 生防菌的筛选及进化树的构建

通过平板对峙试验，筛选出1株具有拮抗效果的杆菌，菌株编号为H13，抑菌效果见图1。抑菌率达42.52%，经16S rDNA鉴定，该菌株与Lysobacter firmicutimachus相似率为99.6%（图2）。

2.2 发酵基础培养基的筛选

由图3可知，H13菌株在LB培养基发酵时，其发酵液的OD600达最高，为0.78，其次为马丁培养基、1/2 R2A培养基，在MS培养基中，发酵液的OD600最低，因此选择LB培养基作为菌株的基础培养基。

2.3 单因素试验结果

2.3.1 不同碳源对H13菌株的影响。

由图4可知，葡萄糖、乳糖、麦芽糖和甘露醇浓度在0.2%～0.6%时，H13菌株的OD600随着糖浓度的增加而增大，在0.6%附近达到最大值，分别为1.187、1.058、1.067和1.029;浓度在0.6%～1.0%时OD600随着糖浓度的增加而减小。蔗糖浓度在0.2%～0.4%时，OD600随着糖浓度的增加而增加，在0.4%附近OD600达到最大，为1.090，浓度在0.4%～1.0%时，随着糖浓度的增加OD600减小;回归分析（表1）表明，培养H13后菌液OD600和糖浓度之间呈二次曲线关系，其中发酵液OD600与蔗糖浓度之间相关达极显著水平，其他糖类与发酵液OD600相关达显著水平。综上所述，葡萄糖浓度在0.6%附近显著高于其他碳源的OD600。

2.3.2 不同氮源对H13菌株的影响。

由图5可知，干酪素和蛋白胨浓度在0.2%～0.6%时，菌株的OD600随着氮源浓度的增加而增大，在0.6%附近达到最大值，分别为1.065和1.024，浓度在0.6%～1.0%时，OD600随着氮源浓度的增加而减小;硫酸铵和蛋白胨浓度在0.2%～0.4%时，OD600随着氮源浓度的增加而增加，在0.4%附近达到最大值，分别为1015和1.024，浓度在0.4%～1.0%时，随着氮源浓度的增加，菌株OD600值减小;回归分析（表2）結果表明，H13菌液培养后OD600和氮源浓度呈二次曲线相关关系，发酵液OD600与蛋白胨和硫酸铵浓度之间相关达显著水平。综上所述，干酪素浓度在0.6%附近显著高于其他氮源的OD600值。

2.3.3 不同无机盐对H13菌株的影响。

由图6可知，硫酸镁浓度为0.05%～0.15%时，菌株的OD600随着无机盐浓度的增加而增大，在0.15%达到最大值，为1.037;碳酸钙浓度在005%～0.10%时，菌株的OD600随着无机盐浓度的增加而增大，在0.10%附近达到最大值，为1.033，浓度在0.10%～020%时随着无机盐浓度的增加，菌株OD600减小。回归分析（表3）结果表明，由H13回归方程得到的最适硫酸镁、碳酸钙和磷酸氢二钾浓度为0.13%、0.12%、0.13%，培养H13后菌液OD600和无机盐浓度之间呈二次曲线关系，其中发酵液OD600与硫酸镁浓度之间相关达极显著水平，与磷酸氢二钾浓度之间相关达显著水平。

2.4 正交试验结果

从表4可以看出，不同水平的蔗糖、葡萄糖、干酪素、硫酸镁对H13的生长量有一定的影响，最佳培养基：蔗糖6 g/L、葡萄糖8 g/L、干酪素6 g/L、硫酸镁1 g/L。

2.5 发酵条件的优化

2.5.1 初始pH。

由图7可知，不同初始pH对菌株生长的影响不同，pH在4.4～7.2时，随着pH的增加，菌株OD600逐渐增加，在pH 7.2附近OD600达到最大值，pH在7.2～9.3时，菌株OD600逐渐减小，因此，溶杆菌H13发酵培养基的最佳初始pH为7.2。

2.5.2 发酵温度。

由图8可知，不同温度对溶杆菌H13的生长有较大影响。当温度在20～28 ℃时，随着温度的升高菌株的生长量逐渐升高，当温度28 ℃附近时，H13的OD600达到最大，当温度在28～40 ℃时，随着温度的升高，菌株H13发酵液中的OD600逐渐下降。因此确定28 ℃为该菌株最佳发酵温度。

2.5.3 发酵时间。

由图9可知，培养时间在10～35 h时，H13菌株发酵液的OD600显著升高，摇床振荡培养35 h附近时，发酵液的OD600达到最大值，继续摇床培养后发现H13菌株的生物量逐渐下降。因此该菌株的最佳发酵时间为35 h。

2.5.4 摇床转速。

由图10可知，不同摇床转速对H13的生长影响较大，当转速在150～180 r/min时，随着转速的升高，该菌株的生长量逐渐升高，当转速为180 r/min附近时，其发酵液OD600最大;当转速继续升高时，菌株发酵液的OD600逐渐下降，因此180 r/min为菌株H13发酵培养基的最佳转速。

2.5.5 接种量。

由图11可知，当接种率在50～300 μL时，发酵液的OD600逐渐升高，当接种量在300 μL附近时OD600最大，在接种量为300～400 μL时，随着接种量的继续增加，H13发酵液的OD600逐渐下降。说明高接种量和低接种量均不利于H13菌株的生长，因此确定最佳接种量为300 μL。

3 结论与讨论

利用溶杆菌防治植物病害的研究较多，姬广海等[9]研究表明，溶杆菌能有效控制魔芋软腐病，还有增产作用，防效可达79.16%，增产14.30%。姜英华等[10]研究表明产酶溶杆菌H11对番茄青枯病有很好的防治效果，达86.4%，且对瓜果腐霉病菌和辣椒疫病病菌抑制率尤为突出。该研究证实H13菌株对马铃薯黑痣病具有防治效果，该菌具有拮抗、溶菌、营养和位点竞争、诱导植物抗病性以及根际促生等多种生防机制[11]。

综上所述，H13的碳源为蔗糖和葡萄糖，最佳氮源为干酪素，最佳无机盐为硫酸镁;结合单因素试验结果进行正交试验，结果显示胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化钠10 g/L，葡萄糖8 g/L，蔗糖6 g/L，干酪素6 g/L，硫酸镁1 g/L;最佳培养条件为初始pH 7.2，发酵温度28 ℃，发酵时间35 h，转速180 r/min，接种量300 μL。

參考文献

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