液相色谱—串联质谱法测定双壳类水产品中原多甲藻酸类贝类毒素

摘 要：建立了双壳类水产品中原多甲藻酸贝类毒素Azaspiracid 1（AZA1）、Azaspiracid 2（AZA2） 和Azaspiracid 3（AZA3）的液相色谱-电喷雾串联质谱检测方法。选用具有基质代表性的扇贝、牡蛎和杂色蛤为研究对象，样品经80%甲醇-水混合溶液提取，正己烷脱脂、氯仿反提萃取并旋转蒸发浓缩后，MAX混合型阴离子交换反相吸附固相萃取柱净化，Luna C18 色谱柱（150 mm×2.0 mm，5 μm，Phenomenex公司）反相液相色谱法分离，乙腈和0.1%甲酸溶液组成的流动相梯度洗脱，正离子扫描，多反应监测（MRM）模式下电喷雾串联质谱法测定和确证，外标法定量。结果表明，3种原多甲藻酸类贝类毒素均在4 min内出峰，检出限均为1.5 μg/kg，在0.3～30 μg/L范围内线性良好，平均回收率大于80%，相对标准偏差（RSD）小于12%（n=6）。

关键词：贝类毒素；原多甲藻酸；双壳类水产品；液相色谱-串联质谱

1 引 言

原多甲藻酸（Azaspiracids， AZAs）贝类毒素是一类脂溶性聚醚生物毒素，由原多甲藻（Properidininm crassipes）产生，碳骨架由40个碳原子组成，分子中有20个立体异构中心和9个环，具有独特的6，5，6-三螺环和环胺结构（化学结构见图1），属氨代螺旋酸类贝类毒素。AZA1在AZAs贝类毒素中最为常见，[TS（][HT5”SS] 图1 原多甲藻酸类贝类毒素化学结构图

Fig.1 Chemical structure of azaspiracids （AZAs）

AZA1： R1=H， R2=CH3 ； AZA2： R1=CH3， R2=CH3； AZA3： R1=H， R2=H.[HT5][TS）]且所占比例最高，AZA2和AZA3则分别是AZA1的8-甲基和22-脱甲基衍生物，这3种贝类毒素构成了原多甲藻酸类贝类毒素的主要成分^[1]。AZAs贝类毒素毒性强且比较稳定，AZAl， AZA2和AZA3对小鼠腹腔注射致死剂量分别为200， 110和140 μg/kg^[2]，人食用含有AZAs贝类后会出现恶心、呕吐、腹泻、胃痉挛等症状。2002年3月，欧洲委员会规定双壳类水产品中AZA1，AZA2和AZA3的最大允许浓度为160 μg/kg （以贝肉计）^[3]。

小鼠生物检测法（MBA）是以往检测贝类毒素的常用方法，但因其存在不能判定多种毒素的具体组分，灵敏度和准确性均欠佳，重现性差等缺点，已被欧盟于2011年采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）法取代^[4]。目前，对AZAs贝类毒素的检测多限于AZA1 [5～8]，而AZA1的测定结果不能作为双壳类水产品中AZAs是否超标的判断依据，且所建检测方法还存在着样品处理操作繁琐，耗时长等问题。本研究针对以上问题，完善了目标分析物的种类，改进了样品处理方法，提高了分析效率，为双壳类水产品中AZAs贝类毒素残留的监控及检测提供了技术支持，为贝类产品的品质控制和质量提高提供了可靠保证。

2 实验部分

2.1 仪器、试剂与材料

API4000液相色谱-串联质谱仪（美国应用生物系统公司），配有电喷雾离子源；T25 basic型均质器（德国IKA公司）；2-16K型高速离心机（德国Sigma公司）；MS3型涡旋混合器（德国IKA公司）； RV 10型旋转蒸发仪（德国IKA公司）；固相萃取装置、MAX混合型阴离子交换反相吸附固相萃取小柱（美国Waters公司）。Mill-Q纯水仪（美国Millipore公司）。

原多甲藻酸标准品：AZA1、AZA2和AZA3（加拿大海洋生物科学研究所，纯度≥95%）；甲醇、乙腈（色谱纯，美国Burdick & Jackson公司）；甲酸（色谱纯，美国Dikma公司）；氯仿（农残级，美国Tedia公司）；正己烷和乙酸钠（优级纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）。实验用水由Mill-Q纯水仪制备。

3 结果与讨论

3.1 质谱条件的选择和优化

取90 μg/L AZAs标准溶液，采用流动注射方式分别注入离子源。在正离子检测方式下对AZAs进行一级质谱扫描获得各分子离子峰[M+H]+，再对各母离子进行二级质谱扫描获得相应的特征子离子峰[M+H-H2O]+ 和[M+H-2H2O]+。然后通过多反应监测（MRM）扫描模式对去蔟电压（DP）、入口电压（EP）、碰撞气能量（CE）、碰撞室出口电压（CXP）等参数进行优化，使分子离子与特征碎片离子强度达到最大，确定最佳质谱参数。AZAs分子结构中C20与C21位上存在两个羟基，二者会被电离， 失去氧原子上的一个n电子，生成奇电子离子，游离基定域于氧上，并诱导β-氢重排到氧上，接着失去H2O^[9]，从而得到[M+H-H2O]+和 [M+H-2H2O]+两个子离子。AZAs的二级质谱图见图2。

3.2 色谱条件的选择

选用Luna C18色谱柱对AZAs进行分离，流动相则选用实验室中常用的乙腈和0.1%甲酸，梯度洗脱。结果表明，3种AZA均具有较高的灵敏度和选择性，且峰形尖锐，在3.0 min附近出峰，与文献[6～8]相比，分析周期明显缩短，且流动相组成简单易得，易与其它检测方法流动相兼容。

3.3 研究对象的选择及样品制备

本实验选取扇贝、牡蛎和杂色蛤作为研究对象。扇贝多见于潮间带到深海，牡蛎通常生活于适宜海区的岩石上，杂色蛤则大多栖息在风浪较小的内湾，且有适量淡水注入的中、低潮区潮间带沙泥滩涂中。因栖息环境的不同，三者的肉质存在一定差异，在双壳类水产品中具有一定的代表性。

对于双壳类水产品样品，在制备过程中需先将其洗净，去壳，再清洗壳内组织，确保试样中无海水和泥沙等杂质。分析前取样品可食部分进行均质处理，既保证试样均匀性， 也利于提取效率的提高。

3.4 样品分离纯化方式和条件的选择和优化

3.4.1 提取条件的选择和优化 欧盟2011年出台了协调标准SOP方法：LC-MS/MS法测定贝类中脂溶性海洋生物毒素，该SOP方法采用100%甲醇提取，过膜后直接上机的方式测定试样中的AZAs等毒素。本文根据AZAs贝类毒素化学结构和理化性质，以及相关文献资料^[6]，分别尝试用100%甲醇和80%甲醇溶液作为提取溶剂对试样中的AZAs进行提取。结果发现，80%甲醇提取效果更佳，在回收率、提取后溶液纯净程度和便于后续净化等方面均有较好的表现。欧盟协调标准SOP方法采用100%甲醇作为提取剂可能是为了兼顾贝类中各种脂溶性海洋生物毒素都有较好的提取效果，而本实验选用的80%甲醇则对AZAs类贝类毒素提取的针对性更强。

为了避免脂肪对提取净化的影响，利用正己烷对80%甲醇提取液进行了脱脂处理。因为甲醇-氯仿体系对于脂溶性目标分析物有较好的提取效率，后续操作在提取液中加入了氯仿进行反提萃取。预实验过程中，考虑到氯仿具有一定的毒性，曾尝试用乙酸乙酯取代氯仿进行反提，但乙酸乙酯与上一步所得提取液不能够很好地分层，反提效果不理想，所以该步骤采用氯仿进行反提。旋转蒸发浓缩时，考虑到AZAs类贝类毒素对热较稳定，设定水浴温度为50 ℃，这样氯仿的浓缩时间明显缩短，使得整个提取方法可操作性更强。为了保证样品提取液在固相萃取柱上能够充分保留，残渣先用1 mL甲醇溶解确保目标分析物不损失后，再加入4 mL水进行润洗。

姚建华等^[6]在提取贝类产品中AZA1时，整个提取过程中有两次氮吹浓缩处理，这就使得整个实验耗时较长，本实验所建提取方法则在具有同样提取效果的情况下有着更加省时快速的优点。

3.4.2 净化条件的选择和优化 AZAs是末端带有羧基的并含有螺环的脂溶性含氮聚醚，兼具亲水和亲脂特性， MAX混合型阴离子交换反相吸附固相萃取小柱对其具有很好的选择性。具体操作中，选取50 mmol/L 乙酸钠溶液对MAX固相萃取小柱进行淋洗，乙酸钠为强碱弱酸盐，溶液pH值偏碱性，这样的酸碱度有利于AZAs完全离子化，使其在MAX固相萃取小柱上的吸附更加牢固；同时50 mmol/L乙酸钠具有一定的离子强度，其与甲醇（95∶5，V/V）混合，对于去除杂质具有很好的效果。洗脱液选用甲醇-甲酸（98∶2，V/V）溶剂体系，甲酸可与AZAs竞争MAX固相萃取小柱上的离子交换位点，甲醇则是非极性基团很好的洗脱剂，二者组合而成的洗脱体系对于AZAs具有非常理想的洗脱效果。整个净化过程，应注意流速不可过快，以防止出现“沟渠效应”而造成回收率降低^[10]。

通过以上提取过程中的氯仿反提萃取，以及净化过程中对AZAs选择性较强的MAX固相萃取小柱等分析手段的应用，本文在保证回收率的前提下最大限度地降低了双壳类水产品自身带来的基质效应。

3.5 检测下限和线性关系

以10倍信噪比（S/N）作为检测下限（LOQ），测得AZAs在扇贝、牡蛎和杂色蛤等双壳类水产品样品中的LOQ均为1.5 μg/kg （浓度为0.3 μg/L）。姚建华等^[7]曾在大连海域贝类样品中检测出AZA1，含量为99.6 pg/g。而本文未过多追求更低的检测下限，在欧盟AZAs总量不超过160 ng/g的检测要求下，完全可以满足双壳类水产品中AZAs类贝类毒素日常检测和监控的需要。

用0.3，1.2，2.4，12和30 μg/L系列梯度浓度AZAs混合标准工作液，依次按方法2.2中描述的仪器条件进行测定。每个浓度重复3次，通过标准溶液浓度Y与对应的仪器响应峰面积平均值X进行线性回归。在0.3～30 μg/L的浓度范围内线性良好，AZA1， AZA2和AZA3的相关系数分别为0.9992， 0.9990和0.9990。

3.6 回收率、精密度和样品分析

欧洲委员会规定双壳类水产品中AZA1，AZA2和AZA3的最大允许浓度为160 μg/kg （以贝肉计）^[4]，即如果样品中AZA1， AZA2和AZA3总量超过了160 μg/kg，则可判定其为阳性样品。对于存在最高残留限量（MRL）的物质，一般设定LOQ， MRL和2MRL 3个标准物质添加浓度水平进行相关的添加回收实验。对于AZAs中的每个组分AZA1， AZA2和AZA3的MRL则可按照160 μg/kg的1/3对其基本限定，即60 μg/kg左右。因此，本文设定1.5， 60和120 μg/kg 3个浓度水平对AZA1， AZA2和AZA3进行添加回收实验。实际测试中，如果待测物浓度高于线性范围则需稀释待测物浓度使之在线性范围内，再通过乘以稀释倍数的折算方式来计算AZAs浓度。以牡蛎为例，空白样品加标（1.5 μg/kg）的MRM色谱图见图3。