感染华支睾吸虫后小鼠肝脏的病理学观察

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【摘要】 目的：了解小鼠感染华支睾吸虫后肝脏的病理变化，为研究华支睾吸虫的致病机制提供参考依据。方法：胃蛋白酶消化法获取华支睾吸虫囊蚴，人工灌胃法感染小鼠，采用病理学方法取材、固定及染色，观察小鼠肝脏的病理学变化。结果：不同感染时间的炎症反应程度存在差异，出现纤维组织增生、胆管壁增厚、嗜酸性囊肿等病理学现象。结论：小鼠感染华支睾吸虫后肝脏出现了显著的病理学改变，这种现象对于研究人体内华支睾吸虫的致病作用具有一定的参考价值。

【关键词】 华支睾吸虫； 囊蚴； 病理变化

Pathological Observation of Liver in Mice Infected with Clonorchis Sinensis/PAN Yu，RONG Wei，LI Zhi-hui，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（30）：015-018

【Abstract】 Objective：To investigate the pathological changes of liver in mice infected with clonorchis sinensis，and to provide the scientific basis for the study of pathogenicity of clonorchis sinensis.Method：The pepsin digestion method was used to obtain metacercaria of clonorchis sinensis，the artificial gastric irrigation was used to infect mouse，the liver tissues were taken from the mice after infection for pathological examination，the procedure included the fixed of body，paraffin section and staining，observed the pathologic changes by microscope.Result：There were differences in the degree of inflammatory reaction at different infection times，pathological changes such as fibrous tissue hyperplasia，eosinophilic cyst，the walls of hepatic bile ducts had thickened and so on.Conclusion：After the mice infected with clonorchis sinensis，the liver showed a remarkable pathological change，and this phenomenon have a certain reference value for the study of the pathogenic role of clonorchis sinensis in human body.

【Key words】 Clonorchis sinensis； Metacercaria； Pathological change

First-author’s address：Qiqihar Medical University，Qiqihar 161006，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.30.005

華支睾吸虫病（Clonorchiasis sinensis）俗称肝吸虫病，是一种重要的食源性寄生虫病，可引起多种肝脏及胆管系统并发症。WHO国际癌症研究署明确胆管细胞癌的致癌物包括华支睾吸虫，成为了全球被忽视的热带病之一，给感染者造成明显的生命质量损失，成为影响食品安全和人民健康的重要因素之一[1-3]。中国作为华支睾吸虫病负担最为严重的国家和感染的高发国家之一[4-6]，需要加强相关研究工作。本研究观察小鼠感染华支睾吸虫后肝脏的病理变化，为研究华支睾吸虫的致病机制提供参考依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康清洁级小鼠，由齐齐哈尔医学院动物实验中心提供。

1.1.2 囊蚴来源 胃蛋白酶消化法获取淡水鱼（麦穗鱼）体内囊蚴，鉴定分离后保存于生理盐水中备用。

1.1.3 试剂与仪器 胃蛋白酶Pepsin（活性1∶3000）（上海蓝季科技发展有限公司），生理盐水，5%～10%甲醛溶液，HE染液，双目显微镜（日本，OLYMPUS），60、80、100目标准检验筛（上海尚筛机械制造有限公司），12号小鼠灌胃针（北京凯辉盛达科技发展有限公司），绞肉机（慈溪市宁汇电器有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 囊蚴的获取 提取麦穗鱼脊背部鱼肉（将阳性鱼用清水洗涤数次后，去除鱼鳍、鱼头、鱼皮及内脏，分离鱼肉），绞肉机粉碎后放入配置好的消化液内消化（消化时，须先将消化液预热，然后放入37 ℃温箱中消化，消化过程中需用玻璃棒搅拌消化液数次），消化后的鱼肉经过分离筛过滤、生理盐水洗涤、分离数次后获取囊蚴，生理盐水内4 ℃保存备用。

1.2.2 小鼠分组 按照随机分配的原则30只小鼠被分成感染组（25只）和对照组（5只）。通过灌喂囊蚴30～40个/只的方式感染小鼠。选择早晨小鼠空腹时进行灌胃，1 mL的注射器安装12号灌胃针头，用生理盐水冲洗2～3次；室温放置保存于生理盐水中的华支睾吸虫囊蚴几分钟后，用吸管将其吸出，放入玻璃平皿中，然后吹打玻璃平皿内的囊蚴，用蒸馏水冲洗几次后进行灌胃[7]。

1.2.3 华支睾吸虫的鉴别 取肝脏，反复生理盐水冲洗后从肝脏近肝门区剪开肝脏，再用手轻轻挤压肝脏，一般挤压方向从肝脏边缘向中央进行，可反复挤压几次，这时从挤出的胆汁中可发现虫体。用毛笔柔软的细毛轻轻挑起虫体至生理盐水中，或直接用吸管吸起虫体放入生理盐水中，但需要生理盐水反复冲洗几次虫体，以去除表面的胆汁，然后蒸馏水清洗，使虫体表面洁净，最后平整放在载玻片中央，镜下观察，进行华支睾吸虫的形态鉴别

1.2.4 肝胆组织病理标本的采集 感染后第10、20、30天颈椎脱位处死所有小鼠（包括感染组和对照组），无菌条件下，快速获取两组小鼠的肝胆系统标本。

1.2.5 病理学观察 常规方法进行病理学检测，标本均采用5%的甲醛溶液固定；然后进行石蜡切片；最后通过常规HE染色后，镜下观察两组小鼠肝胆系统的病理学变化。

2 结果

2.1 小鼠形态观察 （1）灌喂前观察：两组小鼠的体态、食欲及活动情况均无差别。（2）感染后观察：感染组小鼠灌喂囊蚴后，在短暂的适应期后，体态、食欲及活动情况无特别显著变化，但在1周后，尤其在感染囊蚴10 d左右时变化明显，出现生长缓慢，精神萎靡，食欲减退，活动减慢等现象；而对照组小鼠灌喂生理盐水后，体态、食欲及活动情况均无明显变化。

2.2 肝脏表面观察 对照组小鼠肝脏表面光滑，饱满红润，胆管乳白色且粗细均匀，胆汁清亮，见图1。感染组小鼠肝脏肿大，表面密布白色结节，手感粗糙，颜色深浅不一，肝外胆管直径明显增粗，剪破胆管发现管壁明显增厚，管壁内的黏稠物呈现褐色、血色或黄绿色，向破口方向挤压肝胆管，大量华支睾吸虫成虫随之流出，见图2。

2.3 病理学观察 对照组小鼠肝脏病理标本的肝小叶结构清晰，中央静脉位于肝小叶的中央位置，其周围的肝板呈放射状排列，肝血窦位于肝板之间，门管区也清晰可见，此外。还可观察到整齐分布的胆管上皮细胞，见图3、4。观察感染第10天的小鼠肝脏病理标本发现，大量的炎细胞浸润现象，胆管增生明显，胆管上皮细胞也出现了部分坏死脱落现象，在其周围的纤维组织出现了轻度的增生，炎性细胞浸润中以嗜酸性粒细胞为主，见图5。观察感染第20天的小鼠肝脏病理标本：肝吸虫虫体的切面及葵花籽状的肝吸虫虫卵在胆管内清晰可见。由于有大量虫体及虫卵在胆管内的寄生，导致了胆管向周围明显的扩张，加上虫体及虫卵对胆管上皮细胞的刺激作用，使其出现了不同程度的增生，镜下观察发现管腔边缘参差不齐，突出呈乳头状。此外，由于虫体的寄生导致了部分肝小叶的结构遭到破坏，部分胆管上皮细胞出现了较为严重的坏死脱落现象，在其周围的纤维组织出现了中度的增生，炎性细胞浸润中仍然以嗜酸性粒细胞为主，而且局部形成了嗜酸性脓肿，见图6。观察感染第30天的小鼠肝脏病理标本：胆管上皮细胞脱落更为严重，胆管呈囊性扩张，严重扩张的胆管附近出现了肝细胞萎缩现象，大量上皮细胞开始变性、坏死、崩解、脱落。镜下观察胆管结构，部分区域不清晰，炎性细胞浸润更为明显，部分肝细胞已经坏死，见图7。

3 讨论

华支睾吸虫病是一种重要的食源性寄生虫病，关乎国计民生，是我国“十二五”规划重点防治的重点寄生虫病之一[8]，其主要寄生于人和保虫宿主的肝胆管内，引起肝脏损伤、胆道病变、肝硬化、甚至诱发肝癌，尤其是胆管细胞癌[9-10]。感染华支睾吸虫后可致宿主肠道菌群失调，破坏肠道的生理屏障[11]，本实验中小鼠感染华支睾吸虫后，出现了食欲逐渐减退，活跃度降低等现象。

华支睾吸虫引起病变的主要原因是由于大量虫体的机械性刺激、压迫及其分泌物和代谢产物引起胆管上皮脱落、增生，导致管壁增厚、管腔狭窄，引起胆汁流通不畅，易合并细菌感染，出现胆道炎症，严重时可引起癌变。成虫长时间寄生于肝胆管内，刺激胆管内膜及胆管周围组织，引起了不同程度的炎性反应及过敏反应。而且死亡虫体碎片、虫卵、胆管上皮脱落细胞可引起胆管结石，出现胆石症[12]。当大量虫体长时间寄生虫后，感染会更加严重，肝细胞的萎缩和变性现象及其周围纤维组织的增生均可出现在门脉区周围，甚至出现胆汁性肝硬化。

华支睾吸虫病的主要危害性在于肝脏受损。文献[13-14]中報道，长爪沙鼠感染华支睾吸虫后，出血、淤血和间质性炎症反应现象在感染的后第2天就在肝脏被发现；小胆管和成纤维细胞的增生出现在感染的第10天；感染第15天汇管区出现了大量的胆汁堵塞淤积现象。另据报道，豚鼠感染华支睾吸虫后，病理观察发现，在感染第19天～2个月后的豚鼠出现了结构混乱的肝小叶，小胆管与结缔组织出现了增生[15]。研究显示，宿主的肝胆管内是华支睾吸虫成虫的主要寄生部位，其致病机制主要包括虫体运动时的机械刺激，虫体分泌物及代谢产物引起的免疫反应，造成了肝组织的免疫损伤，由此引起肝脏组织发生相应的病理变化，导致胆管炎、胆囊炎及其他炎症性病变。本次实验结果显示，感染华支睾吸虫后，小鼠肝脏受损严重，病理形态学变化明显。感染后肝脏及肝胆管的病理变化与感染程度及感染时间呈正相关：感染早期程度相对较轻，大体解剖见病变轻度，但呈广泛弥漫性改变。尽管胆管增生明显，出现了部分胆管上皮细胞的坏死脱落现象，但周围纤维组织的增生程度较轻，以嗜酸性粒细胞浸润为主。感染20 d左右时，解剖见肝内胆管壁增厚，胆管扩张明显，胆管上皮均有不同程度的增生，主要原因在于成虫寄生时的粘附以及分泌物和排泄物的刺激导致。胆管内可见华支睾吸虫虫体及虫卵，部分胆管上皮细胞坏死脱落，周围有中度纤维组织增生，肝脏淤血严重，胆管上皮细胞排列不规则出现水肿、坏死现象，局部形成嗜酸性脓肿。感染30 d后，大体解剖见大量的结节状凸起出现在了肝脏表面，病理组织标本观察发现，肝内出现广泛病变且明显，胆管呈现高度扩张，肝细胞萎缩现象出现在胆管周围，大量虫体聚集在肝胆管内，导致了管道的阻塞和胆汁的滞留，如若合并细菌感染，胆管炎、胆管肝炎等炎症反应将随之出现。镜下还可发现胆管已经呈现囊性扩张，大量上皮细胞出现变性、坏死、崩解、脱落现象，甚至部分区域的胆管结构镜下不清晰。

综上所述，小鼠感染华支睾吸虫囊蚴后，无论是小鼠的体态、食欲及活动情况等肉眼所见，还是从病理学角度观察感染不同时间的小鼠肝脏及肝胆管，均出现了明显的变化，对于研究在人体感染华支睾吸虫后肝胆管出现的病理变化具有一定的借鉴意义和参考价值。

参考文献

[1]钱门宝，陈颖丹，周晓农.从认识到实践-纪念华支睾吸虫发现140周年[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2014，32（4）：247-252.

[2] WHO.Working to Overcome the Global Impact of Neglected Tropical Diseases：First WHO Report on Neglected Tropical Diseases[M].Geneva：World Health Organization，2010.

[3]钱门宝，陈颖丹，周晓农.中国华支睾吸虫防控的差距[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2016，34（4）：373-376.

[4] Fürst T，Keiser J，Utzinger J.Global burden of human food-borne trematodiasis：a systematic review and meta-analysis[J].Lancet Infect Dis，2012，12（3）：210-221.

[5]許隆祺，陈颖丹，孙凤华，等.全国人体重要寄生虫病现状调查报告[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2005，23（5）：332-340.

[6]方悦怡，陈颖丹，黎学铭，等.我国华支睾吸虫病流行区感染现状调查[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2008，26（2）：99-103.

[7]刘继鑫，孙艳宏，郭家，等.华支睾吸虫在小鼠体内的发育观察[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2014，32（5）：406-407.

[8]罗波，赵玉敏，莫刚，等.急性大剂量华支睾吸虫感染大鼠血清学指标和肝脏病理形态学改变的研究[J].中国病原生物学杂志，2017，12（4）：341-344.

[9]石梦辰，陈庭金，周丽娜，等.华支睾吸虫severin蛋白对肝癌细胞SMMC-7402增殖、迁移及侵袭作用的初步研究[J].热带医学杂志，2016，16（2）：127-130.

[10]王彩琴，余新炳，李学荣.华支睾吸虫感染与胆管癌发生发展关系的研究进展[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2015，33（2）：142-146.

[11]蔡连顺，祝丽玲，宫梓琳，等.肠道微生态在华支睾吸虫致宿主肝功能损伤中的作用研究[J].中国微生态学杂志，2017，29（1）：16-18，21.

[12]马瑞红，乔铁，罗振亮，等.华支睾吸虫流行区胆石症患者胆囊结石类型及华支睾吸虫感染情况[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2015，33（3）：167-171.

[13]高广汉，王运章，武烽，等.华支睾吸虫病实验病理学研究[J].中国寄生虫病防治杂志，1994，7（3）：197-200.

[14]朱师晦，潘世定，何雅明，等.曲江县带头地区中华分枝睾吸虫病暴发流行调查报告[J].广东医学，1963，1（3）：101-104.

[15]张晓丽，李懿宏，王凯慧，等.华支睾吸虫病大鼠肝细胞凋亡的实验研究[J].哈尔滨医科大学学报，2005，39（1）：55-57.

（收稿日期：2017-05-23） （本文编辑：董悦）