茶树EGCG合成过程相关的Ankyrin基因的克隆与表达分析

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摘 要 运用RACE技术，从茶树新品系“1005”嫩芽中克隆出Ankyrin基因全长cDNA（2 034 bp），5′UTR和3′UTR分别为353 bp和55 bp，编码541个氨基酸，命名为CS-Ankyrin。基因全长序列在线blast比对分析结果表明，该基因与葡萄、蓖麻、可可和杨树的Ankyrin序列的一致性分别为78%、78%、77%和77%。生物信息学分析显示，CS-Ankyrin锚蛋白重复序列是由5个ANK单元组成，该蛋白是定位在质膜上起作用的跨膜疏水蛋白，但疏水性较差；系统进化树分析表明，该基因编码的氨基酸与芝麻的亲缘关系最为接近。比较CS-Ankyrin在不同发育阶段叶片的表达和EGCG含量变化结果表明，CS-Ankyrin基因在3个品系不同样品的表达趋势与其EGCG含量变化趋势一致，芽头>二叶>四叶；亚细胞定位试验结果表明，CS-Ankyrin蛋白定位在细胞膜上起作用。推测该蛋白可能参与EGCG的储存和跨膜运输。

关键词 茶树；锚蛋白重复序列；生物信息学；EGCG；亚细胞定位

中图分类号 S571.1 文献标识码 A

Abstract The full-length cDNA（2 034 bp） of one Ankyrin gene named CS-Ankyrin was cloned from the Camellia sinensis“1005”using RACE technique， which encoding a 541 amino acid protein. Bioinformatics analysis showed that， with low hydrophobicity， the encoded protein consisting of 5 ANK was hydrophobic and functioned in plasma membrane. Phylogenenetic analysis showed that the protein encoded by CS-Ankyrin had the closest genetic relationship with that in Sesamum indicum. Comparing the expression level of CS-Ankyrin and the EGCG content at different developmental stages of three cultivars， CS-Ankyrin expression was observed to vary with a similar trend observed for each cultivar： bud>the second leaf>the fourth leaf. The changes in EGCG was also found to follow a similar trend to that for gene expression. The subcellular localization results showed that the protein was located in the cytomembrane. We speculate that the protein is related to storage and transmembrane transport of EGCG.

Key words Camellia sinensis；Ankyrin repeat；Bioinformatics；EGCG；Subcellular localization

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.07.015

EGCG（Epigallocatechin gallate）是茶叶品质的关键核心成分之一，也是茶多酚中最有效的活性成分，为类黄酮化合物，具有很强的抗氧化、抗癌、抗辐射、抗糖尿病、抗高血脂等功效[1-4]。因此，EGCG在食品加工、医药、化工等领域具有广阔的应用前景。EGCG可以作为食品添加剂或者开发为功能性食品，有研究也表明，EGCG在食品体系中也可以发挥很强的抗氧化效果，抗氧化能力比VE还强[5]。喝茶，特别是高EGCG茶对于提高肌体免疫能力、抗衰老、抗癌、降血脂、预防糖尿病等都具有很好的保健作用[2，6-9]，不同茶树品种发育程度不同的茶树新梢芽叶，EGCG的含量不尽相同，虽然有关类黄酮化合物生物合成的基本途径已经探明[10-11]，相关产物的组分变化也有相关报道[12]，但EGCG生物合成的分子机制仍然比较模糊。茶树类黄酮化合物生物合成的一些结构基因已经被分离鉴定，如PAL（Phenylalanine Ammonialyase）、 ANR（Anthocvanidin Reductase）、 ANS（Anthocyanidin Synthase）、 DFR（Dihydro Flavonol 4-reducta）、 CHS（Chalcone Synthase）、 CHI（Chalcone Isomerase）、 F3H（Flavanone 3-hydroxylas）、 LAR（Leucoanthocyanidin Reductase）等[13-15]，但决定茶树EGCG生物合成的关键基因还未完全明确。

1987年，Breeden和Nasmyth在2个酵母细胞周期调控蛋白中发现了锚蛋白重复（ankyrin repeat，ANK）序列模体。锚蛋白重复序列普遍存在于真核、原核及病毒中，主要功能是介导蛋白质间的相互作用[16-17]。各个ANK蛋白中ANK的数目、一级序列及其空间结构上均有差异，因此ANK模体能够和不同的蛋白质配体结合，从而实现功能的多样化，包括形成细胞骨架的完整性、参与植物自身的防疫、生物体的生长发育、物质的合成与运输。目前，关于锚蛋白重复序列的研究主要集中在动物体，植物锚蛋白的研究相对较少，只在拟南芥、烟草和水稻等模式植物中有报道[18]，茶树中有关锚蛋白重复序列的研究还未见报道。