白桦丹醌通过抑制PC9细胞迁移及PC9诱导的破骨细胞形成阻止肺癌骨转移的实验研究

【摘要】 目的：研究白桦丹醌在抗人类肺腺癌细胞系PC9骨转移中的作用。 方法：采用左心室注射稳转荧光素酶的PC9细胞构建肺癌骨转移动物模型，研究白桦丹醌对PC9骨转移的抑制作用；采用SRB研究白桦丹醌对PC9的毒性作用，采用transwell迁移实验检测其对PC9体外迁移的抑制作用；采用PC9与Raw264.7共培养构建肺癌诱导破骨形成并用白桦丹醌处理，研究白桦丹醌对PC9诱导形成破骨细的抑制作用。结果：动物实验显示，心室注射PC9细胞40 d后，对照组5只裸鼠均出现明显转移，而用药组虽然也出现4只裸鼠转移，但用药组转移灶的光子值（2 759 200±2 670 290）显著小于对照组（8 732 800±6 191 628）（P<0.05）。SRB显示2 μM白桦丹醌对PC9无明显杀伤作用，但可显著抑制PC9的迁移能力及显著抑制PC9诱导的破骨细胞形成，组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：白桦丹醌可通过抑制PC9迁移及抑制PC9诱导的破骨细胞形成的方式抑制PC9骨转移，显示其作为抗肺癌骨转移药物的应用前景。

【关键词】 肺腺癌； 白桦丹醌； 破骨细胞； 迁移； 骨转移

肺癌是目前全世界发病率和死亡率最高的癌症之一。美国每年大约170 000人死于肺癌，占整个癌症死亡总数的30%[1]。与其他恶性肿瘤一样，肺癌的转移是造成治疗失败和患者死亡的首要原因[2]。骨是肺癌最常见的转移部位之一，约30%～40%的进展期肺癌出现骨转移[3]，其中大部分为溶骨性转移。尽管近年来对于癌症骨转移的治疗取得了一定的进步，但肺癌骨转移的中位生存期仍徘徊在半年左右，成为医学界亟待解决的一大难题。研制安全高效的癌症骨转移抑制剂是癌症治疗领域的难点和热点。

最近的研究表明，白桦丹醌（Plumbagin）对乳腺癌骨转移及大细胞肺癌的化疗具有一定的作用[4-5]，但目前还没有白桦丹醌用于肺腺癌骨转移研究的相关报道。Li等[4]的研究表明，白桦丹醌在不明显影响Raw264.7增殖的浓度下可有效抑制破骨细胞的形成和活性。鉴于此研究基础，笔者进一步研究白桦丹醌对于肺腺癌骨转移的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 材料 荧光素酶（luciferase）标记的人肺腺癌细胞系PC9及小鼠巨噬细胞系Raw264.7由华东师范大学—长征医院骨肿瘤联合研究中心惠赠；白桦丹醌粉末、荧光素酶底物（D-luciferin）购自于美国sigma公司；培养皿购自丹麦Corning公司；Trap染色试剂盒购自美国sigma公司，重组鼠RANKL、M-CSF购自美国R&D公司；磺酰罗丹明B（suHbrhodamine B，SRB）购于美国Sigma公司；RPMI 1640及α-MEM培养基、胰蛋白酶、小牛血清购自美国Gibco公司；Boyden小室购自美国Millipore公司；其余试剂均为市售分析纯产品。

1.2 方法

1.2.1 SRB检测白桦丹醌对PC9的毒性作用 将处于对数生长期的PC9细胞按5×103个/孔的密度将细胞接种到96孔板，在37 ℃，5% CO2，95% 湿度的条件下培养，使其贴壁。24 h后更换含有不同浓度白桦丹醌的培养基，每个浓度设3个复孔。48 h后加入25 μL/孔的50%三氯醋酸溶液，4 ℃固定1 h；冲洗5遍，室温晾干；加入SRB染液，室温染色10 min。倒掉SRB染液，用1%冰乙酸洗5遍，室温晾干；再加入100 μL/孔10 mM 的Tris碱液，酶标仪读取OD515（optical density，OD）值。

1.2.2 迁移实验 将肿瘤细胞重悬于无血清的RPMI1640培养基，细胞浓度调整为5万/200 μL， 取200 μL接种于穿梭小室的上层，在下面的小室中加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基600 μL。36 h后使用4%多聚甲醛固定，结晶紫染色，并在显微镜下拍照，统计迁移的肿瘤细胞。

1.2.3 肺腺癌细胞PC9诱导破骨细胞形成实验 将PC9与Raw264.7按照1：10的比例混合接种于48孔板（细胞总数为0.3×104），待细胞贴壁后更换含不同浓度白桦丹醌的培养基。培养基添加M-CSF及 RANKL各10 ng/mL，每3天换液。3～5 d后，经多聚甲醛固定及Trap染色，统计破骨细胞数目。Trap染色按照试剂盒说明书进行。

1.2.4 肺腺癌PC9骨转移的检测 将处于对数生长期的PC9细胞消化、重悬于PBS，密度调整为1×105/100 μL。通过左心室注射将细胞接种于4～5周的裸鼠体内（购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司）。小鼠随机分为DMSO组和白桦丹醌组（3 mg/kg体重），每组5只，每2天腹腔给药一次。 30 d后检测IVIS活体成像信号及光子值（美国Caliper Life Sciences公司），并经X线成像仪检测骨破坏程度（美国Kodak公司）。

1.3 统计学处理 采用SPSS 16.0统计软件进行统计学分析，计量资料以（x±s）表示，组间比较采用t检验，检验水准为双侧α=0.05。

2 结果

2.1 白桦丹醌对PC9骨转移的抑制作用 参照Li等[4]的研究结果，本研究实验组小鼠给予3 mg/kg白桦丹醌，每2天给药1次。30 d后开始拍摄IVIS活体成像跟踪监测小鼠的骨转移情况并用X线成像仪进行确认。研究发现白桦丹醌可明显抑制PC9骨转移的发生（图1）：至左心室注射PC9细胞后的40 d，对照组（control）均出现明显转移；而白桦丹醌组（PL）只有4只出现转移，且荧光信号

（2 759 200±2 670 290）明显弱于对照组（8 732 800±6 191 628）（图1A上、图1B）；经X线确认，对照组小鼠胫骨发生明显的溶骨性缺损，而白桦丹醌组的变化不明显或者明显弱于对照组（图1A下）。以上结果表明，白桦丹醌可有效抑制PC9的骨转移。大量研究表明，抑制癌细胞迁移及癌细胞诱导形成的破骨细胞形成和活性可有效治疗癌症骨转移[6-9]，因此，笔者进一步研究白桦丹醌抑制PC9骨转移的作用是否也与此两种方式有关。

2.2 白桦丹醌对PC9诱导形成破骨细胞的抑制作用 为了研究白桦丹醌抑制PC9骨转移是否与抑制肺癌细胞诱导的破骨细胞形成有关，笔者采用PC9与raw264.7细胞的共培养体系进行验证。将PC9与Raw264.7按1：10的比例进行接种，同时添加10 ng RankL、可明显诱导形成破骨细胞（图2A左），而Raw264.7单独培养添加10 ng Rankl时无明显破骨细胞形成。在此基础上，笔者进一步研究白桦丹醌对PC9诱导形成的破骨细胞的抑制作用，Li等的研究已经证明2 μM白桦丹醌对Raw264.7的增殖无明显影响，但明显抑制破骨细胞的形成及活性[4]。因此，笔者也检测2 μM白桦丹醌对PC9诱导破骨细胞形成的影响。研究也发现，2 μM白桦丹醌可明显抑制PC9诱导的破骨细胞形成（图2右、图2B）。

2.3 白桦丹醌对PC9迁移能力的抑 制作用 为了进一步研究白桦丹醌抑制PC9骨转移是否与抑制肺癌细胞的迁移有关，笔者采用transwell迁移实验对其进行验证。研究发现，白桦丹醌2 uM时可显著抑制PC9的体外迁移能力（图3）。

2.4 白桦丹醌对PC9细胞的毒性作用 为了排除白桦丹醌对PC9骨转移的抑制作用是由白桦丹醌的毒性作用造成，笔者进一步研究2 μM白桦丹醌对PC9增殖的影响。研究发现，2 μM白桦丹醌对PC9无明显杀伤作用（图4），当2 μM白桦丹醌作用于PC9时约90%的肿瘤细胞存活。以上实验说明，2 μM白桦丹醌对PC9及Raw264.7均无明显的毒性作用，白桦丹醌对PC9迁移及其诱导形成破骨细胞的抑制不是主要通过抑制PC9增殖所引起。

3 讨论

骨是肺癌最为常见的转移部位之一，肺癌一旦发生骨转移，常导致骨痛、高钙血症、病理性骨折、脊髓压迫甚至瘫痪等并发症，严重影响患者的生存质量及生存期，加速患者的死亡进程，给患者及其家庭和社会带来沉重负担[10-11] 。但是目前对于癌症骨转移的治疗方案有限，主要为双磷酸盐和针对RankL的单克隆抗体德尼单抗（Denosumab），其中德尼单抗过于昂贵；而双磷酸盐虽然对破骨细胞介导的骨吸收有一定效果，但是对癌症治疗的作用存在较大争议。鉴于此，美国肿瘤临床学会对于尚未发现骨转移的癌症患者不推荐使用双磷酸盐进行治疗[12]。因此，若能开发一种既能抗肺癌迁移又能抑制肺癌在骨中生长侵袭的药物，将大大提高肺癌骨转移的预防及治疗效果。

白桦丹醌，是维生素K3的类似物，是白花丹（（Plumbago zeylanica）根的提取物。白花丹已经在中国传统医学中安全使用了几个世纪，用于治疗多种疾病，包括微生物感染和过敏反应等。大量研究表明，白桦丹醌有显著的抗肿瘤作用，包括促进肿瘤相关的凋亡、侵袭、血管新生等[13-17]。最近的研究表明，白桦丹醌可有效抑制破骨细胞的形成及抑制乳腺癌骨转移[4]，而在肺癌骨转移领域还未见报道。本研究采用白桦丹醌处理人肺腺癌细胞系PC9及其骨转移动物模型，观察其对肺癌骨转移的影响，并研究其作用机制，为将其进一步开发应用提供理论依据及实验基础。

Li等[4]的研究显示，2 μM的白桦丹醌可明显抑制破骨细胞的形成及骨吸收能力，而对肿瘤细胞及raw264.7细胞无明显的毒性作用。笔者的研究也发现，2 μM的白桦丹醌对PC9细胞无明显杀伤作用。而此浓度可有效地抑制PC9的迁移及抑制PC9与raw264.7共培养形成的破骨细胞形成；动物实验也显示白桦丹醌可有效抑制PC9骨转移。

综上所述，白桦丹醌可通过抑制肺腺癌细胞诱导形成的破骨细胞及抑制肺癌的迁移两种方式阻止肺癌骨转移，笔者将进一步研究其具体的分子机制。

参考文献

[1] Dela Cruz C S， Tanoue L T， Matthay R A.Lung cancer： epidemiology， etiology， and prevention[J]. Clin Chest Med，2011，32（4）：605-644.

[2] Pantel K， Alix-Panabières C.Circulating tumour cells in cancer patients：challenges and perspectives[J].Trends Mol Med，2010 ，16（9）：398-406.

[3] McErlean A， Ginsberg M S.Epidemiology of lung cancer[J].Semin Roentgenol，2011，46（3）：173-177.

[4] Li Z，Xiao J，Wu X，et al.Plumbagin inhibits breast tumor bone metastasis and osteolysis by modulating the tumor-bone microenvironment[J]. Curr Mol Med，2012，12（8）：967-981.

[5]于涛，马力，朱彧.Plumbagin对人类大细胞肺癌NL9980细胞系抑癌作用的研究[J].肿瘤研究与临床，2011，12（11）：45-46.

[6] Kang Y， Siegel P M， Shu W.A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone[J].Cancer Cell，2003，3（6）：537-549.

[7] Rolfo C， Raez L E， Russo A， et al. Molecular target therapy for bone metastasis： starting a new era with denosumab， a RANKL inhibitor[J]. Expert Opin Biol Ther，2013，28（45）：456-478.

[8] Woodward E J，Coleman R E. Prevention and treatment of bone metastases[J].Curr Pharm Des，2010，16（27）：2998-3006.

[9] Azim H，Azim H A.Targeting RANKL in breast cancer： bone metastasis and beyond[J].Expert Rev Anticancer Ther，2013，13（2）：195-201.

[10] Coleman R E.Skeletal complications of malignancy[J].Cancer，1997，45（80）：1588-1594.

[11]肖建如.对脊柱转移癌外科治疗策略再认识[J].中国脊柱脊髓杂志， 2011，21（7）：531-532.

[12] Hillner B E，Ingle J N，Berenson J R，et al.American Society of Clinical Oncology guideline on the role of bisphosphonates in breast cancer. American Society of Clinical Oncology Bisphosphonates Expert Panel[J]. J Clin Oncol，2000，18（6）：1378-1391.

[13] Tian L， Yin D， Ren Y，et al. Plumbagin induces apoptosis via the p53 pathway and generation of reactive[J].Mol Med Report，2009，5（1）： 126-132.

[14] Sun J， McKallip R J. Plumbagin treatment leads to apoptosis in human K562 leukemia cells through increased ROS and elevated TRAIL receptor expression[J]. Leuk Res，2012，35（10）： 1402-1408.

[15] Subramaniya B R， Srinivasan G， Sadullah S S， et al.Apoptosis inducing effect of plumbagin on colonic cancer cells depends on expression of COX-2[J].PLoS One，2013，6（4）：e18695.

[16] McKallip R J， Lombard C， Sun J，et al. Plumbagin-induced apoptosis in lymphocytes is mediated through increased reactive oxygen species production，upregulation of Fas， and activation of the caspase cascade[J]. Toxicol Appl Pharmacol，2010，247（1）：41-52.

[17] Ahmad A， Banerjee S， Wang Z， et al. Plumbagin-induced apoptosis of human breast cancer cells is mediated by inactivation of NF-kappaB and Bcl-2[J].J Cell Biochem，2008，105（6）：1461-1471.

（收稿日期：2014-01-02） （本文编辑：陈丹云）