Podoplanin标记的微淋巴管密度与结直肠癌淋巴转移的关系

【摘  要】目的：研究结直肠癌组织中podoplanin标记微淋巴管的特点，探讨其与肿瘤淋巴结转移的关系。方法：收集承德医学院附属医院手术切除结直肠癌和癌旁组织标本34例及正常结直肠组织标本20例，用MaxVision法免疫组织化学染色检测podoplanin表达，计算podoplanin标记的微淋巴管密度（MLVD），并结合结直肠癌临床病理特征进行相关性分析。结果：结直肠癌旁MLVD（22.53±4.93）明显高于肿瘤中心区（7.44±1.78）（P<0.01），两者均明显高于正常结直肠组织（5.40±1.88）（P<0.01）。结直肠癌旁高MLVD与肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移及Dukes分期（P<0.01）有关，与患者的性别、年龄均无关。结论：结直肠癌旁高MLVD与肿瘤组织的淋巴结转移密切相关。肿瘤旁MLVD是判断肿瘤淋巴管生成和淋巴结转移的重要指标。

【关键词】结直肠癌;Podoplanin;淋巴结转移;微淋巴管密度;免疫组织化学

结直肠癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人类健康，其发病率在我国高居恶性肿瘤第三位。淋巴道转移是其转移的主要途径，大多数结直肠癌早期就可以发生淋巴转移^[1]。近年来随着新型淋巴管标记物的出现，肿瘤新生淋巴管形成与肿瘤转移的关系逐渐成为研究的热点。本研究运用免疫组织化学方法检测Podoplanin在34例結直肠癌中的表达，计算结直肠癌中微淋巴管密度（micro-lymphatic vessel density， MLVD），探讨它们与结直肠癌淋巴结转移的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料

收集承德医学院附属医院2017年5月～2018年5月手术切除结直肠标本34例，其中男性20例，女性14例;年龄35～78岁，中位年龄53.6岁。组织学分型：高分化腺癌8例、中分化腺癌16例、低分化腺癌10例。临床Dukes分期： A+B期18例、C+D期16例。全部病例术前均未行化疗或放疗，术后均经病理确诊。每例标本取结直肠癌、癌旁组织（距瘤缘小于1cm）各1块。另外随机选取其中20例距离肿瘤10cm以上远的组织作为正常对照。

1.2方法

全部标本经4%甲醛固定、石蜡包埋、连续切片（厚4μm）、常规HE染色及免疫组化MaxVision两步法染色。兔抗人Podoplanin单克隆抗体购于北京博奥森生物技术有限公司，MaxVision试剂盒购于福州迈新生物技术开发有限公司，操作按照试剂盒说明书进行。抗原修复采用EDTA（PH8.0）高压锅高温修复，DAB显色，中性树胶封片。

1.3 淋巴管计数

Podoplanin阳性染色定位于淋巴管内皮细胞的细胞质，呈棕黄色颗粒状。参照Weidner报道的方法对微淋巴管密度进行计数，Podoplanin染色后，单个内皮细胞或内皮细胞簇着色阳性分别计为一个阳性微淋巴管，不一定要找到完整的管状结构，先在低倍镜（×40倍）下分别选取结直肠癌周边区、中心区以及正常结直肠组织Podoplanin染色阳性微淋巴管最丰富的区域，即“热点（hot spots）”，然后在高倍镜（×200）视野下计数MLVD，每例计数3个视野，并求其均值^[2]。

1.4 统计学处理

所有数据均用SPSS for Windows 18.0统计软件分析处理，所有计数资料用表示，组间比较用t检验，检验水准为α=0.01。

2 结果

2.1 结直肠癌及癌旁组织中微淋巴管形态特征及淋巴管密度分析

结直肠癌旁组织MLVD明显高于癌及正常组织（表1），癌组织内淋巴管多塌陷、闭塞，少量为狭窄的腔隙，癌旁组织淋巴管管腔形状不规则，多有不同程度的扩张，腔内有时可见少量淋巴细胞，偶见有癌细胞。正常组织中淋巴管分布于粘膜层、粘膜下层、肌层和外膜中，形态大小不一，壁较薄。

2.2 结直肠癌组织中淋巴管密度与临床病理因素的关系

结直肠癌中心区MLVD与结直肠癌临床病理各因素之间无相关性。但在结直肠癌旁MLVD与肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移及Dukes分期（P<0.01）有关，而与患者性别、年龄均无关（表2）。

3 讨论

侵袭和转移是恶性肿瘤的主要生物学特征，也是临床治疗失败、致死的主要原因之一^[3]。在实体恶性肿瘤中， 淋巴系统可能早于血液系统，成为肿瘤转移的最初途径^[4]。在肿瘤生长的早期，尤其是转移瘤生长早期，其营养物质的提供主要靠弥散方式及微淋巴管、新生淋巴管通过扩张形式提供，且随着肿瘤生长淋巴管数量也在增加，管壁结构发生改变^[5]，因此恶性肿瘤淋巴转移过程中起关键作用的是淋巴管的生成。由于以前缺乏特异的淋巴管标志物，长期以来，对肿瘤淋巴管的研究相对滞后于对肿瘤血管的研究，随着近年来相继发现了肾小球足突细胞膜黏蛋白（Podoplanin），血管内皮生长因子受体（VEGFR）-3，肿瘤胚胎性抗原M-A的单克隆抗体（D2-40），淋巴管内皮透明质酸受体（LYVE）-1等能特异性标记淋巴管内皮细胞的抗体，极大地方便了对淋巴管与肿瘤关系的研究。淋巴管生成也成为肿瘤研究新的热点， 抑制肿瘤新生淋巴管为控制肿瘤淋巴道转移提供了新的靶点^[6]。

Podoplanin首先在患有嘌呤霉素所诱导的肾病鼠模型的肾小球足突细胞表面发现，是分子量为43KD的Ⅰ型黏液样跨膜糖蛋白，由166个氨基酸构成，有一个单一高度保守的跨膜区域，胞内域有9个氨基酸构成，胞质内的C端有两个潜在的磷酸化位点，胞外域有一个相对保守的6个潜在的氧连接型糖基化位点^[7]。Podoplanin主要表达于生长中和成熟的淋巴管内皮细胞表面，在血管内皮细胞上不表达，是特异性较强的淋巴管内皮细胞标记物^[8]。本研究结果显示，未在由Podoplanin标记的微淋巴管内发现红细胞，有的微淋巴管内可见淋巴细胞，少数微淋巴管内可以发现癌栓，血管内皮细胞均未表达，这表明Podoplanin标记微淋巴管的特异性和敏感性较好。

Schoppmann等研究发现肿瘤组织内新生淋巴管由单层内皮细胞构成，缺乏连续的基底膜，内皮细胞连接疏松，有许多潜在腔隙，通透性增加，从而使肿瘤细胞容易进入淋巴管，形成淋巴转移^[9]。本研究结果显示，结直肠癌组织中大多数是由单层内皮细胞构成的淋巴管，这些内皮细胞间的连接稀疏，存在很多潜在腔隙。癌旁组织的MLVD高于癌组织及正常组织，差异有统计学意义，有淋巴结转移组高于无淋巴结转移组，差异有统计学意义。结直肠癌中MLVD与淋巴结转移有关，微淋巴管的形成为肿瘤转移提供了有利条件。虽然已经证明癌组织中存在新生淋巴管，但癌组织与癌旁淋巴管形态存在明显差异，肿瘤内部淋巴管多因肿瘤细胞的挤压而导致塌陷、闭塞，癌旁组织的淋巴管的形态大多数是增生扩张的。肿瘤内部淋巴管可能没有功能，功能性淋巴管主要位于癌旁，由于癌旁增生的功能性淋巴管增加了肿瘤细胞与淋巴管接触的面积，从而促使了肿瘤的淋巴转移^[10]。

本研究显示，Podoplanin可以特异性标记淋巴管上皮细胞，结直肠癌癌旁MLVD与肿瘤浸润深度、淋巴结转移及临床分期显著相关，新生淋巴管在肿瘤转移过程中有重要作用。检测肿瘤及癌旁组织内MLVD可以作为评估结直肠癌生物学行为的一项指标。检测MLVD可能有助于评估结直肠癌患者的预后并指导临床治疗。

参考文献

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