HPV相关宫颈癌的筛查与免疫治疗

[摘要] 宫颈癌是世界范围内第二大常见妇科肿瘤，每年有>230 000人死于宫颈癌。导致宫颈癌的危险因素主要为持续性高危型人乳头状瘤病毒感染宫颈的移行带上皮，其机制可能是机械性原因，也可能是生物性原因。通过免疫干预可以打破免疫耐受，重新激发机体免疫系统消除肿瘤细胞的能力，随着免疫学和基因工程学的发展，免疫治疗已成为临床肿瘤治疗的第4种治疗模式。本文对近年来宫颈癌的HPV相关筛查和免疫治疗进展进行综述。

[关键词] HPV；宫颈癌；免疫治疗

[中图分类号] R711.74 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2013）28-0019-03

宫颈癌是世界范围内第二大常见妇科肿瘤，而在发展中国家妇女中其发病率位居第一[1]，且发病年龄年轻化。人类乳头状瘤病毒是宫颈癌的主要危险因素，且其分型与宫颈浸润癌间有明显的相关性，故HPV的检测及为重要[2]。继传统手术、放化疗后免疫治疗已经成为治疗宫颈癌的新观点被大家所接受。本文对近年来宫颈癌的HPV相关筛查和免疫治疗进展进行综述。

1 人类乳头状病毒（human papilloma virus，HPV）

1.1 HPV结构与功能

HPV是一种球形无包膜的环状双链DNA病毒，在核内复制，并形成有20面衣壳的无胞膜病毒颗粒。HPV基因组包含三个区，其中有两个编码区，即早期基因区和晚期基因区，可产生两类蛋白。具体包括：

1.1.1 早期区（ E区） 长约4 kb，含8个开放读码框架（ORF），编码DNA复制所需的非结构蛋白，编码的病毒蛋白依次为：E6、E7、E1、E8、E2、E4、E3和E5。E6和E7主要与细胞转化及HPV的致癌性有关，编码的E6、E7蛋白引起宫颈上皮细胞永生化。E6与野生型P53结合，促进其降解。导致P53抑制细胞生长的功能丧失；E7结合Rb基因并抑制其活性，导致DNA合成增加。以上两种结果均使宿主细胞的细胞周期失控；E1参与病毒复制，其蛋白具有ATP依赖性解旋酶活性；E2编码转录因子，参与转录调节的主要功能是抑制E6和E7的表达。E6和E7的过表达会使细胞持续保持增殖能力，却丧失掉分化能力。而完整的病毒颗粒（需要衣壳蛋白的组装），只能产生在已经分化/开始角化的细胞中，故为了保证不断产生完整的病毒颗粒（所有生物的本质特性之一都是尽可能繁殖最多的后代），E2始终与E6和E7相互作用，让细胞保持在病毒基因表达和宿主细胞分化的平衡点上；E4编码晚期胞质蛋白，其表达产物可与细胞骨架蛋白相互作用并介导病毒组装，与病毒的成熟有关，它在分化型细胞中表达最强，能结合并破坏细胞角质蛋白网，形成凹空细胞（koilocyte）；E5具有较弱的转化活性，其表达产物可下调HLA-1的表达，刺激细胞生长。

1.1.2 晚期区（L区） 长约3 kb，含L1和L2。这两个晚期读码框主要编码HPV的衣壳蛋白。L1高度保守，为种特异性抗原；L2高度可变，是型特异性抗原。L2蛋白也是免疫组化技术确定HPV感染的主要识别位点。

1.1.3上游调节区（ upstream regulatory region，URR区） 为非编码区（noncoding region，NCR区），长约1 kb，主要作用为控制早、晚转录区的转录和病毒颗粒的合成，其位置位于E基因始端与L区末端之间。

1.2 HPV分型与检测方法

HPV具有高度宿主细胞特异性，可引起人类多种增殖性上皮病变，包括乳头状瘤（疣）和瘤样病变。目前已知的HPV病毒超过百种，感染生殖道的HPV超过40种。绝大多数的宫颈癌与HPV感染有关。HPV感染率在人群中虽然比较高，但大多感染是自限性的。HPV感染后病灶可以是多灶性、多中心性及一种以上HPV病毒感染。HPV6、11型是常见的低危亚型，主要与良性外生性生殖道疣和尖锐湿疣有关。HPV16、18、31等为高危类型，见于各级别CIN病变及宫颈癌[3]。HPV16是宫颈鳞状细胞癌常见感染类型，HPV18是宫颈腺癌常见类型。

最近研究发现，连续的同一类型高危型HPV感染所形成的HPV感染更容易造成宫颈癌的进展。这些研究结果促使高危型HPV的检测广泛应用于临床工作中，其重要意义包括：宫颈癌和其癌前病变的筛查，对ASCUS患者的分流管理，CIN治疗后残留或复发病变的预测和随访标志物，辅助细胞学对宫颈病变的日常筛查工作，以及指导HPV疫苗的研究和使用。HPV 基因分型和定量研究对提高临床诊断具有重要意义[4，5]。目前HPV核酸检测技术主要包括杂交捕获试验（HCⅡ）、聚合酶链反应（PCR）、原位杂交、DNA印迹杂交、低密度基因芯片导流杂交技术等，这些技术会对HPV与宫颈癌之间关系的基础和临床研究提供有力的工具。下面就最近常用的检测技术简单介绍。

杂交捕获试验（HCⅡ）是目前临床广泛应用的检测HPV感染的重要方法，它可以确定待测的HPV-DNA含量，其优点是方法标准化，检测效率高；缺点是不能对HPV分型，但当任何一种类型的HPV DNA超过阈值，检验的结果为阳性。一定要正确解读 HCⅡ 的检测结果：≥1 说明阳性，即感染了HR-HPV，但结果中的数值大小并不与病变的严重程度呈正比；<1说明阴性，表示未检测出所有13 种HR-HPV DNA 或样本中不存在HR-HPV DNA，但不能完全除外存在极少量、未能被检测出来的HR-HPV DNA。例如处于潜伏感染状态的HPV，其DNA拷贝维持在一个很低的水平，常常难以被检测到；如果低于但接近1.0，而且可疑HR-HPV感染应当重新采集样本再次检测。

亚能人乳头瘤病毒分型基因芯片检测系统是一种PCR-反向点杂交技术，其优点是高灵敏度、高特异性、高通量，重复性好[6，7]，它一次性检测HPV 15 种最常见高危基因型，依次为：HPV16、18、45、31、33、52、58、35、59、56、39、51、73、68、82（这也是2003年世界卫生组织国际癌症研究所（IARC）根据HPV相对危险度公布的15最常见高危基因型）。对模板DNA的纯度要求低，不需要分离病毒或细菌，无需培养细胞，DNA 粗制品即可作为扩增模板，可检测不同来源的标本，包括宫颈脱落细胞、液基细胞学标本、疣体组织、石蜡组织切片等粗制的DNA作为模板进行扩增。

导流杂交是Hybribio的核心技术，其主要原理是主动地将目标分子导向固定在薄膜纤维上抓取探针，再与捕捉的分子进行杂交产生复合物，而其余不受限制的分子将穿过薄膜后被清除，既省时又节约反应物，该技术远优于传统杂交法。Hybribio DNA快速杂交仪的设计（获美国专利6，020，187），是基于其发明的“导流杂交”原理（获美国专利5，741，647），使分子间的相互作用，由传统的二唯平面的相互作用提升到三维空间的相互作用。仪器只需少量的样本和试剂，可大大减低运作成本。利用该技术可以一次性检测的HPV亚型包括：①高危亚型：HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68；②低危亚型：HPV6、11、42、43、44；③中国人群常见型：HPV53、66、CP8304，共21种。

后两种技术是HPV分型研究，若与HCⅡ这一定量研究联合应用可能对患者的诊治具有更好的指导作用。

2 HPV疫苗

由于HPV在宫颈癌中的重要作用，而HPV感染具有一定普遍性[7]，针对HPV 感染的疫苗开发应用和普及成为最近各国研究的焦点[8-10]。上面提到，HPV基因有两种衣壳蛋白：主要衣壳蛋白（L1）和次要衣壳蛋白（L2），而病毒则被这两种结构蛋白包被。当HPV感染人体后，如果机体能够针对HPV衣壳蛋白L1和L2产生中和抗体，就能够预防HPV的感染。

2.1 预防性疫苗

预防性疫苗的原理就是通过重组DNA技术表达LI或LI和L2蛋白，组装成病毒样颗粒（virus-like particles， VLPs），诱导机体产生中和性抗体，预防HPV感染。目前有两种疫苗已被美国FDA认证上市：Cervarix疫苗（美国葛兰素史克公司研制），为包含HPV16、18的VLPs；Gardasil疫苗（美国默沙东公司研制），包含HPV16、18、11、6的VLPs。Cervarix疫苗主要用于宫颈癌前病变和宫颈癌的预防，已被获准在10岁以上的女性中使用。Gardasil疫苗用于预防由HPV16、18、11、6型感染引起的生殖器疣以及感染、不典型性病变、癌前病变及癌症，而使用人群的年龄为女性9～45岁及男性9～26岁。这两种疫苗疗效显著，预防HPV短暂或持续感染的疗效达到近100%，并且非常安全，但目前无法了解是否终身有效，所以有待对其接种的远期效果进一步研究。

2.2 治疗性疫苗

除了预防性疫苗，HPV治疗性疫苗也是研究的热点。HPV治疗性疫苗的抗原主要来源于HPV早期蛋白[11]。E6和E7蛋白在诱导和保持细胞恶性表型中起重要作用，宫颈癌细胞不易通过抗原丢失来逃脱免疫作用。因此，E6和E7成为抗原特异性治疗宫颈癌疫苗的理想靶蛋白[12]。目前主要的疫苗类型包括：HPV多肽疫苗、蛋白疫苗、载体疫苗和核酸疫苗。

2.2.1 HPV 多肽疫苗[13-15] 其优点是安全纯度高，容易储存和处理， 有理想的靶特异性；而缺点为：①存在个体差异性；②免疫原性差。其原理为在离体或是在体的条件下通过促发细胞毒T 淋巴细胞（CTL）反应，而对肿瘤细胞起杀伤作用。

2.2.2 蛋白疫苗 其优点为安全、易耐受、有免疫原性。其原理为纯化的病毒蛋白诱导抗体和辅助性T 细胞免疫反应以及CTL 反应。蛋白疫苗成为目前HPV 免疫的研究热点之一。一些蛋白疫苗已进入临床试验阶段。

2.2.3 HPV载体疫苗[16，17] 其原理为将编码病毒蛋白基因整合至机体细胞中，由机体细胞再合成病毒蛋白，从而引发一系列的免疫应答反应，。

2.2.4核酸疫苗 其优点为能从多方面提高免疫反应，并且制备简单，易储存、成本低，可以通过多种途径免疫接种。其原理为编码蛋白的核酸结构与自然感染途径表达的蛋白一样被机体加工处理，从而启动了针对该抗原的体液及细胞免疫的一种疫苗[18-20]。

3树突状细胞免疫治疗

树突状细胞（dendritic cell，DC）为抗原提呈细胞，是体内唯一能激活T细胞免疫的细胞，而肿瘤的细胞免疫主要是T细胞免疫，在HPV相关肿瘤局部增加DC数量可明显抑制肿瘤进展。

DC广泛分布于除脑以外的组织和器官，但数量较少，仅占外周血单核细胞数的不足1%，最初是从小鼠脾组织中分离发现的，因其形态具有树突样突起而命名。DC 的主要功能是摄取、处理传递和提呈抗原，通过激活T 淋巴细胞而启动特异性免疫。成熟的DC 还能分泌IL-12 等细胞因子，上调趋化因子的表达水平，启动特异性T 淋巴细胞免疫反应。因此，DC 的肿瘤免疫治疗广泛应用于各种恶性肿瘤的治疗研究。

通过对肿瘤免疫机制的研究，预防性疫苗对HPV感染的保护作用，而HPV疫苗这种特异性免疫治疗将对宫颈癌的预后产生重大改善，从而最大限度的限制宫颈癌的发生以及提高患者的生存质量及时间。

[参考文献]

[1] Walboomers JM. Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide[J]. J Pathol，1999，189（1）：12-19.

[2] Galani E，Christodoulou C. Human papilloma viruses and cancer in the post-vaccine era[J]. Clin Microbiol Infect，2009，15（11）：977-981.

[3] Bosch FX，Burchell AN，Schiffman M，et al. Epidemiology and natural history of human papillomavirus infections and type-specific implications in cervical neoplasia[J]. Vaccine，2008，26（Suppl 10）：1-16.

[4] Lrincz AT. Screening for cervical cancer：new alternatives and research[J]. Salud Publica Mex，2003，45（Suppl 3）：376-387.

[5] Cuzick J，Arbyn M，Sankaranarayanan R，et al. Overview of human papillomavirus-based and other novel options for cervical cancer screening in developed and developing countries[J]. Vaccine，2008，26（Suppl 10）：29-41.

[6] 范文生，杨怡卓，吕亚莉，等. 基因芯片技术检测宫颈病变中HPV 感染的临床研究[J]. 中华医院感染学杂志， 2009，9（7）：745-747.

[7] 李瑞珍，吴瑞芳，乔友林，等. 应用基因芯片技术检测高危型人乳头瘤病毒在宫颈癌筛查中的评价[J]. 中华医学杂志，2006，86（5）：307-311.

[8] Bruni L，Diaz M，Castellsagué X，et al. Cervical human papillomavirus prevalence in 5 continents：meta-analysis of 1 million women with normal cytological findings[J]. J Infect Dis，2010，202（12）：1789-1799.

[9] Mariani L，Venuti A. HPV vaccine：an overview of immune response，clinical protection，and new approaches for the future[J]. J Transl Med， 2010， 8（1）：105.

[10] Pelucchi C，Esposito S，Galeone C，et al. Knowledge of human papillomavirus infection and its prevention among adolescents and parents in the greater Milan area，Northern Italy[J]. BMC Public Health，2010，10：378.

[11] Padilla-Paz LA. Human papillomavirus vaccine：history，immunology，current status，and future prospects[J]. Clin Obstet Gynecol，2005，48（1）：226-240.

[12] de Jong A. Enhancement of human papillomavirus （HPV） type 16 E6 and E7-specific T-cell immunity in healthy volunteers through vaccination with TA-CIN[J]. Vaccine，2002，20（29-30）：3456-3464.

[13] 石菁菁，李小平，崔恒. 宫颈癌免疫治疗及预防研究进展[J]. 中国实用妇科与产科杂志，2003，19（3）：183-185.

[14] 徐道华，夏永鹏，邱宗荫，等. 宫颈癌治疗性疫苗的设计、合成及其生物学效应[J]. 免疫学杂志，2004，20（6）：446-449.

[15] 徐道华，夏永鹏，邱宗荫，等. 干扰素对宫颈癌治疗性脂肽疫苗抗肿瘤作用的研究[J]. 现代医药卫生，2004，23（20）：2479-2480.

[16] 陈怀增. 宫颈癌HPV 疫苗研究现状[J]. 实用妇产科杂志，2004，20（2）：70-71.

[17] 徐道华. 子宫颈癌治疗性疫苗的研究进展[J]. 免疫学杂志，2004， 20（3）：46-49.

[18] 吴卉娟，刘少扬，江大琼，等. 宫颈癌基因治疗[J]. 国外医学：肿瘤学分册，2004，31（2）：145-148.

[19] Huh JJ. Trandsduction of adenovirus mediated wild-type p53 after radiotherapy in human cervical cancer cells[J]. Gynecol Oncol，2003， 89（2）：243-250.

[20] Bilsland AE . Selective ablation of human cancer cells by elomerase specific adenoviral suicide gene therapy vectors expressing bacterial nitroreduct base[J]. Oncogene，2003，22（3）：370-380.

（收稿日期：2013-06-03）