高脂高糖与低剂量链脲佐菌素诱导的糖尿病肾病大鼠模型的建

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[摘要] 目的 建立高脂高糖與低剂量链脲佐菌素（STZ）诱导的SD大鼠的早期糖尿病肾病（DN）模型，模拟早期DN的病理改变及肾功能改变。 方法 将SPF级正常雄性SD大鼠30只按照体重随机分为正常组、模型组。正常组大鼠给予普通饲料喂养，模型组大鼠高脂饲料喂养8周后，腹腔注射STZ 35 mg/kg，形成糖尿病模型后，继续高脂高糖饲料喂养4周后，观察两组大鼠肾脏病理改变、生化及肾功能各项指标的改变情况。 结果 模型组大鼠体重显著低于正常组（P < 0.01），而随机血糖值显著高于正常组（P < 0.01），且达到糖尿病成模标准。模型组大鼠血清胰岛素水平显著低于正常组，相对肾重、24 h尿微量白蛋白、α1-微球蛋白、β2-巨球蛋白值显著高于正常组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。模型组病理特征表现为肾小球基底膜增厚，系膜增宽，肾小球及肾小管糖原物质、胶原纤维聚集等。 结论 此造模方法可模拟早期DN的基本特征。

[关键词] 高脂高糖；链脲佐菌素；糖尿病肾病

[中图分类号] R587.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）06（b）-0012-04

Establishment of high-fat and high-glucose and low dose of Streptozocin induced rat models of diabetic nephropathy

YAO Lan1 ZHANG Yujie2，3 WANG Jian3 LIU Jing3 LI Linlin3 WANG Ye3 LAN Yi4 MAO Xinmin5

1.Staff Room of Chinese Medicinal Resources， College of Traditional Chinese Medicine， Xinjiang Medical University， Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi 830011， China； 2.Department of Pharmacy， the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University， Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi 830011， China； 3.Staff Room of Pharmacology， College of Basic Medicine， Xinjiang Medical University， Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi 830011， China； 4.The Second Department of Cadres， Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine， Xinjiang Medical University， Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi 830000， China； 5.College of Traditional Chinese Medicine， Xinjiang Medical University， Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi 830011， China

[Abstract] Objective To establish the early diabetic nephropathy （DN） rat model induced by high-fat and high-glucose and low dose of Streptozocin （STZ）， so as to simulate the pathologic and renal function changes of early DN. Methods Thirty SPF level of normal male SD rats were divided into normal group and model group by weight. Normal group was fed with normal diet， model group was fed with high-fat and high-glucose diet for 8 weeks continuously， then 35 mg/kg of STZ was injected intraperitoneally to establish diabetic rats model， after that， high-fat and high-glucose diet was fed for 4 weeks continuously. Renal pathological changes， biochemical and renal function indexes of two groups were observed. Results The body weight of rats in the model group was significantly lower than that of normal group （P < 0.01）， while the random blood glucose level was higher than that of normal group （P < 0.01）， which had reached to standard of diabetes mellitus. The level of serum insulin in the model group was lower than that of normal group， the values of relative kidney weight， 24 h microalbuminuria， α1-microglobulin， β2-macroglobulin were higher than those of normal group， the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. The pathological characteristics of model group presented the thickening of glomerular basement membrane， mesangial broadening， accumulation of glycogen and collagen fiber in both glomerulus and kidney tubules. Conclusion This molding method can imitate the basic characteristics of early DN.

[Key words] High-fat and high-glucose； Streptozocin； Diabetic nephropathy

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病的主要微血管并发症，是终末期肾病发生的主要原因[1-2]。2型糖尿病人群中有1/4的患者有明显的肾脏功能损害[3-4]。DN发病机制较复杂，目前尚无针对性及特异性药物治疗[5]。建立能够更好复制人类DN发病过程及病理特征的动物模型，则是深入阐明DN发病机制及进行新药研发的前提基础[6-7]。美国糖尿病并发症协会（animal models of diabetic complications consortium，AM？鄄DCC）给出了理想的DN动物模型标准，但没有任何动物模型能够完全符合该标准[8]。本研究通过高脂高糖饲料长时间喂养Sprague Dawley（SD）大鼠，以低剂量链脲佐菌素（STZ）诱导SD大鼠建立DN动物模型，以期探索符合DN发病机制和病理特征的动物模型。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

SPF级SD大鼠，8～10周龄，体重200～250 g。由新疆医科大学（以下简称“我校”）动物实验中心提供，动物合格证编号：65000700000045。

1.1.2 动物饲养环境

所有大鼠均饲养在我校实验动物中心的SPF级饲养室中。

1.1.3 主要试剂

STZ（Sigma美国，批号S0130），血糖试纸（Roch德国，批号ECS000056），柠檬酸钠（上海西唐生物科技有限公司，批号B1065），羧甲基纤维素钠（CMCNa）（北京索莱宝科技有限公司，批号9004-32-4），二甲双胍（中美上海施贵宝制药有限公司，批号20140212），尿微量白蛋白、α1-微球蛋白（α1-MG）、β2-巨球蛋白（β2-MG）放射免疫检测试剂盒（北京北方生物技术研究所，批号20150112）等。

1.1.4 主要仪器

DT5-1B低速冷冻离心机（北京时代北利离心机有限公司），冷冻干燥机（上海析宇仪器有限公司），VT1200石蜡切片机（Leica德国），5424SZX7-1093光学显微镜（Olympus日本），BS-120全自动生化仪（Mindary深圳），Varioskan Flash酶标仪（Thermo美国），GC-2010放免仪（北京科普顺科有限公司）等。

1.2 实验方法

1.2.1 动物饲养方法及喂养饲料

大鼠分笼饲养，每笼5只。自由进水、进食。实验过程中，空白对照大鼠喂养普通飼料（我校动物中心提供）；糖尿病大鼠喂养高脂高糖饲料（实验人员自行制作，并经高压灭菌处理后使用），饲料配方如下：蔗糖20%、猪油10%、胆固醇2.5%、胆酸钠0.5%、基础饲料67%。

1.2.2 DN动物模型的建立

将8～10周龄、体重200～250 g的SD大鼠30只适应性喂养1周后，按体重随机分为正常组、模型组，分别给予正常饲料、高脂饲料喂养8周后，对模型组大鼠腹腔注射溶解于柠檬酸钠缓冲液中的STZ溶液35 mg/kg，7 d后，尾静脉检测大鼠随机血糖，以随机血糖>16.7 mmol/L为糖尿病模型成模标准。在此基础上，继续采用相同饲料喂养4周后，处理动物，采集标本。参照文献[9]，2型DN大鼠需具备以下条件：随机血糖≥13.8 mmol/L，并伴有胰岛素抵抗；出现尿蛋白、肾功能异常及相应肾组织病理学特征，视为模型建立成功。

1.2.3 观察指标及检测方法

1.2.3.1 大鼠一般状态 观察造模前、造模后、给药干预后大鼠的表观变化，主要包括毛色、精神状态、活动情况、饮水、进食等变化。

1.2.3.2 大鼠肾脏指数 大鼠处理后，取出肾脏，生理盐水清洗后电子天平称重。计算大鼠的相对肾重（KW/BW），公式如下：KW/BW=肾脏重量（mg）/大鼠体重（kg）。

1.2.3.3 大鼠血清样本与尿样检测 血样中，血糖采用全自动生化仪检测。尿样中，微量白蛋白、α1-MG、β2-MG采用放免法进行检测。

1.2.3.4 肾脏病理学检测 将浸泡在4%中性多聚甲醛中固定的大鼠左肾组织经乙醇梯度洗脱、石蜡包埋、切片后，用于病理染色。

1.2.3.5 苏木精-伊红（HE）染色 苏木精水溶液染色后的石蜡切片经自来水冲洗返蓝后，0.5%的伊红溶液染色，梯度脱水、透明，风干，树胶封片。结果可见：细胞核呈现蓝色，细胞质呈粉红色。结果分析方法：将染色后的切片置于显微镜下，400×放大观察，拍照。在每张切片中随机选择30个肾小球，对每个肾小球的系膜增宽、基底膜增厚程度进行等级评分。

1.2.3.6 高碘酸-雪夫（PAS）染色法 Schiff液染色10 min，冷水冲洗10 min，苏木精对细胞核染色3～5 min，梯度洗脱、透明，风干，树胶封片。结果可见：肾组织糖原为PAS染色反应阳性物质，在肾小球、肾小管及肾间质中呈现紫红色或红色颗粒状，细胞核蓝色，其他组织部分呈淡粉色。结果分析方法：在每张切片中随机选择30个肾小球，对每个肾小球中糖原面积进行等级评分。

1.2.3.7 Masson染色方法 石蜡切片在苦味酸乙醇溶液中分色1 min。冲洗复染后，置于磷钼酸中染色5 min，加入醋酸苯胺蓝溶液中染色10 min，梯度脱水、透明，风干，树胶封片。结果可见：胶原纤维阳性染色呈蓝色，肌纤维、纤维素、红细胞呈红色，细胞核呈黑蓝色。结果分析方法：在每张切片中随机选择30个肾小球，对每个肾小球中胶原纤维染色面积进行等级评分。

1.3 统计学方法

所有数据均采用SPSS 16.0统计软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用独立样本t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠状态变化情况

STZ诱导的糖尿病大鼠在成模后继续高脂高糖饲料喂养4周的过程中，模型组大鼠出现显著的多饮、多食、多尿、消瘦、精神萎靡、毛发枯竭的表现，说明模型组大鼠已出现明显的糖尿病症状。同时持续性高血糖导致3只大鼠死亡，成模率为80%。

2.2 大鼠血糖及体重变化

成模后4周内，模型组大鼠体重值显著低于正常组（P < 0.01），血糖值显著高于正常组（P < 0.01），且随机血糖>16.7 mmol/L，达到成模标准。见表1～2。

2.3 两组大鼠肾功能指标比较

模型组大鼠血清胰岛素水平显著低于正常组，相对肾重、24 h尿微量白蛋白、α1-MG、β2-MG值显著高于正常组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表3。

2.4 成模后大鼠肾脏病理变化情况

HE染色结果可见，正常组大鼠肾小球及肾小管未见明显异常。模型组部分肾小球出现明显系膜增宽、基底膜增厚，肾小管出现空泡样病变、淋巴细胞浸润，肾间质水肿等现象（图1，封三）。PAS染色可见，正常组肾小球及肾小管未见异常变化，未见明显紫红色糖原沉积。模型组部分肾小球系膜内，紫红色糖原沉积物明显，部分肾小管一定程度扩张，细胞内可见糖原染色物（图2，封三）。Masson染色结果可见，正常组肾小球、肾小管、肾间质胶原纤维染色正常。模型组可见肾小球基底膜一定程度增厚，胶原纤维染色明显，部分肾小管基底膜增厚，出现一定程度扩张及空泡样病变，肾间质胶原纤维沉积明显（图3，封三）。HE染色结果显示，模型组肾小球系膜增宽、基底膜增厚程度评分显著高于正常组（P < 0.01）；PAS染色结果显示，模型组肾小球中糖原面积评分显著高于正常组（P < 0.01）；Masson染色结果显示，模型组胶原纤维染色面积评分显著高于正常组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）（图4）。

3 讨论

目前使用的DN动物模型主要有三种类型：自发型、诱发型、转基因型DN动物模型[10]。自发型DN模型指动物未经任何有意识的人工处置，在自然情况下发生基因突变，疾病的异常表现，通过育种保留下来的DN模型动物。此类模型较为接近人类DN发病过程，但由于饲养和育种成本较高，成模周期较长，一定程度上制约了该模型的广泛使用；转基因型DN动物模型是将外源基因整合在动物基因组内，并通过育种遗传给后代的一类动物。此类模型由转入的外源基因引起，产生疾病的原因清楚，模型动物的症状单一[11]。但其技术水平要求较高，操作比较复杂，费用较高，所以使其应用受到一定限制；诱发型2型DN动物模型主要模拟人类2型DN发生发展的过程，其原理为采用高脂、高糖饲料喂养大鼠1个月左右使大鼠產生胰岛素抵抗，腹腔或尾静脉注射STZ破坏大鼠胰岛细胞，使动物部分丧失分泌胰岛素功能而模拟2型糖尿病的发生，继续喂养4～8周，可出现DN早期特征，但时间较长[12]。为进一步缩短造模时间，可采用高脂饲料+单肾结扎（或单肾切除）+低剂量腹腔注射（或静脉注射）STZ诱导DN大鼠模型，造模共需6周时间，可出现2型糖尿病所致的典型肾脏病变特征。但由于造模过程中需要进行肾脏结扎或肾脏切除手术，因此模型成活率较低[13-14]。近年来研究表明，糖脂代谢紊乱与DN发病密切相关[15]。基于此原理，本研究采用长时间高脂高糖饲料喂养大鼠8周，低剂量STZ（35 mg/kg）诱导形成糖尿病模型后，继续喂养高脂高糖饲料直至形成DN。结果表明，在形成糖尿病模型后的第4周，大鼠血糖水平显著升高，同时胰岛素水平显著低于正常组，说明大鼠已经由胰岛素抵抗阶段进入胰岛素代偿性分泌障碍阶段。早期肾功能损伤标志性指标α1-MG、β2-MG及24 h尿微量白蛋白水平显著高于正常组[16-20]。本研究采用与杨亦彬等[21]相似的造模方法，4周后大鼠蛋白水平与其相似。不同于前者的是，4周观察期，大鼠继续喂养高脂高糖饲料，因此肾脏病理改变较前者更为复杂，已经出现早期DN肾功异常及肾脏病理特征，可用于DN早期动物模型的研究。

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（收稿日期：2017-03-05 本文编辑：张瑜杰）