新伐他仃对单肾切除糖尿病老龄鼠肾脏波形蛋白表达的影响

【摘要】目的:观察辛伐他仃对单肾切除糖尿病老龄鼠血生化指标、波形蛋白表达,探讨新伐他仃的肾脏保护作用。方法:32只15月龄清洁级SD大鼠随机分为正常对照,肾切对照,糖尿病组,新伐他仃组。给予相应治疗后12周测定大鼠生化指标,对肾组织HE、PASM染色,镜下观察组织,免疫组化检测波形蛋白表达。结果:糖尿病组生化指标较对照组显著升高﹙P<0.05﹚;肾小球系膜增厚,足突融合,基底膜增厚﹙P<0.05﹚;肾小管扩张,上皮细胞水肿,损伤指数显著升高﹙P<0.05﹚;治疗组尿素氮、肌酐等较糖尿病组显著下降﹙P<0.01);治疗组甘油三酯、胆固醇与糖尿病组相比无明显变化﹙P﹥0.05﹚;治疗组与糖尿病组相比波形蛋白表达显著下降﹙P<0.01﹚。结论:治疗后肾脏病理改善,免疫组化发现新伐他仃减少波形蛋白异常表达。

【关键词】新伐他仃;老龄鼠;波形蛋白;单肾切除

doi:10.3969/j.issn.1006-1959.2010.05.019 文章编号:1006-1959(2010)-05-1047-03

Protective effect of simvastatin in uninephrectomize STZ induced diabetic aging rat Master candidate LiuxuequnLIU Xuequn,SHI Hui

【Abstract】Objective:To explore the protective effect of simvastatin on the kidney of uninephrectomized STZ induced diabetic aging rat.Method:Thirty two fifteen-month-old SD rats were randomly assigned to normal control group,uninephrectomized control group,simvastatin treatment group and Diabetic group After 12 weeks,biomedical markers were determined,the renal pathology changes were observed under light and electron;expression of vimentin were detected by immunohistochemistry.Results:biomedical markers of group D were singnifcantly increased compared with those of group C﹙P<0.05﹚,markers of group S were decreased compared with those of group D﹙P<0.05﹚;mean glomerular area and total number glomerular cells of group D were higher than those of other groups ﹙P<0.05﹚,expression of vimentin in group S were decreased compared with those in group D.Conclusion:treatment with simvastatin,the pathology of kidney were improved;simvastatin may play a protective role by dowegulating vimentin.

【Key words】Uninephrectectomize;Aging;Simvastatin;Vimentin

他仃类是一种临床常用的降血脂药物,通过对胆固醇合成途径的限速酶HMG-COA还原酶的抑制,降低血清蛋固醇,最近肾脏疾病的临床和实验研究中发现,他汀类药物的肾保护作用并不完全依赖降脂效应,中间纤维具有严格的组织特异性,来源于同一基因家族,具有高度同源性,中间纤维与细胞分化关系密切,波形蛋白是一种中间纤维蛋白,由单一多肽链构成,主要分布在中胚层来源的组织中,而角蛋白质纤维存在于上皮细胞,结蛋白纤维,存在于肌细胞。研究发现肾脏固有细胞转分化在肾脏纤维化发生发展中起十分重要作用。其转化程度与肾功能下降的程度相平行。通过老龄鼠单肾切除后,给予一次性腹腔注射40mg/kg链脲佐菌素,破坏胰岛β细胞,制成糖尿病模型,辛伐他汀(8mg/kg/day)溶于CMC液灌胃干预治疗,探讨他汀类药物不依赖降血脂的肾脏保护作用。

1.材料和方法

1.1 实验材料。

1.1.1 实验动物:健康、雄性、15月龄、清洁级SD大鼠32只,体重480-550克,动物生产许可证号:SCXK(苏)2007-0023由南通大家动物实验中心提供。

1.1.2 主要仪器与设备:LKB-V超薄切片机,LKB公司(瑞士),显微数字图像分析系统,ZEISS公司(德国),倒置显微镜IX70,OTYMUPS公司(日本),OTYMPUS BX50光学显微镜,OTYMUPS公司(日本),IBAS2.5全自动图像分析系统,IBM公司(日本)。

1.1.3 主要试剂:链脲佐菌素,Sigma公司(美国),辛伐他汀,杭州默沙东制药有限公司。

1.2 实验方法。

1.2.1 动物模型的制备和分组:32只15月龄清洁级SD大鼠随机分为正常对照(N组),肾切对照(C组),糖尿病组(D组),新伐他仃组(S组)。

1.2.2 标本收集和处理。

1.2.3 血尿生化指标及肥大指数的测定。

1.2.4 电镜观察。

1.2.5 光镜检查:石蜡切片的制备(通大附院脏病理室),PASM染色(通大附院病理教研室)。

1.2.6 免疫组化。

1.2.7 统计方法:运用stata8.0统计软件分析,所有数据均采用x±s表示,多组间两两比较采用q检验,差异显著性:P<0.05。

2.结果

2.1 一般情况:正常对照组大鼠饮食饮水情况、精神状态、日常活动均正常;肾切对照组饮食饮水情况、精神状态、日常活动正常;糖尿病组大鼠在注射STZ后2天即出现多尿,多饮,多食症状,随病程的延长,上述症状更加显著,毛发色泽暗淡,精神萎靡,活动减少;治疗组一般情况与同期糖尿病组相比明显的改善。

2.2 各组大鼠血糖、甘油三油(TG)、胆固醇(TC)、尿素氮、肌酐、肾重/体重、24小时尿蛋白定量的情况。

2.2.1 空腹血糖:D组、S组大鼠血糖在实验期均维持在较高水平>16.67mmlo/L,两组间无明显差异(P>0.05);N组、C组大鼠血糖在试验期均维持在正常水平,两组间无明显差异(P>0.05),D组与N组、C组相比有明显差异(P<0.05)。

2.2.2 血脂:D组甘油三酯、胆固醇值与N组、C组相比有明显差异(P<0.05=,S组甘油三酯、胆固醇水平与D相比无明显差异(P>0.05)。

2.2.3 尿素氮、肌酐:S组同单肾切除糖尿病模型组相比减少(P<0.01),N组、C组相比比较明显差异(P>0.05),D组与N组、C组相比明显差异(P<0.05)。

2.2.4 肥大指数(肾重/体重):D组较同期N组均显著升高,(P<0.05),S组同D组相比明显减少(P<0.01),N组、C组相比无明显差异(P>0.05)。

2.2.5 24h尿蛋白定量:D组较同期N组均显著升高(P<0.05),S组同D组相比明显减少(P<0.01),N组、C组相比无明显差异(P>0.05)。

表2-1 各组大鼠一般检测指标比较(x±s)

检测指标N 组(n=8)C组(n=8)D组(n=7)S组(n=7)

血糖(mmol/l)9.06±1.389.08±1.6132.53±5.31▲#31.79±3.74▲#

甘油三酯(mmol/l)0.69±0.080.73±0.812.96±0.45▲#7.78±0.29▲#

胆固醇(mmol/l)1.55±0.211.72±0.142.55±0.34▲#2.45±0.29▲#

肌酐(mmol/l)79.5±2.0782.12±5.1497.17±6.08▲#﹡90.71±5.41▲#

尿素氮(∪mol/l)6.75±0.079.32±0.6315.90±1.16▲#﹡13.10±1.02▲#

肾重/体重3.36±0.174.15±0.8310.39±0.94▲#﹡7.94±0.85▲#

24小时尿蛋白(mg/24h)16.1±1.2725.21±1.65105.5±1.16▲#﹡48.14±3.29▲#

注:与N组相比▲P<0.05,与C组相比#P<0.05,与S组相比﹡P<0.01。

2.3 各组大鼠肾脏组织病理学。

2.3.1 光镜下PASM染色所见:肾组织基底膜呈黑色,肾小球基质系膜呈棕黑色,D组肾小球内细胞数减少肾小球囊壁增厚,系膜增生,基底膜断裂,系膜宽度超过毛细血管径,呈弥漫分布,小管结构紊乱,S组较D组病变减轻,C组与N组病理改变无明显差异,(图3-2)。

图3-1 PASM染色a为C组 b为D组c为N组 d为S组

2.3.3 电镜下超微结构:D组可见系膜区系膜基质增生,上皮细胞足突融合,使原来附在基底的排列有序的足状突起贴附基底膜上,毛细血管基底膜增厚,基底样物质均匀增多,基底膜细微结构消失;S组较D组病变减轻,基质增生减轻,上皮细胞足突融合减轻(P<0.01);C组与N组病理改变无明显差异(P﹥0.01)(图3-3)。

图3-2 电镜图片a为C组 b为D组 c为N组 d为S组

2.3.4 免疫组化所见病理改变:波形蛋白只在正常大鼠血管壁、、肾小球、间质少量表达,近曲小管上皮细胞胞浆内无表达;D组肾小球少量表达,近曲小管上皮细胞胞浆内大量阳性表达,间质表达增加(P<0.05);C组肾小球、间质、小管上皮细胞胞浆内少量阳性表达,与N组相比,差异无统计学意义(P﹥0.01)。

图3-3 vimentina为C组 b为D组 c为N组 d为S组

3.讨论

Corsini A等研究发现[1],辛伐他仃对单侧肾切除STX诱导的糖尿病大鼠,可减少尿蛋白量,抑制细胞外基质形成。本实验12周大鼠肾脏组织病理学检查显示D组较C组、N组大鼠出现明显的肾脏肥大、肾小球体积增加、基底膜增厚。

免疫组化发现,N组、C组肾脏vimentin在肾小球,小管、间质病变在糖尿病肾病中的作用也越来越引起重视。D组免疫组化显示小管波行蛋白表达增加,而N组和C组肾小管波行蛋白质表达不明显,推测肾小管上皮受损后可能发生表型转化,表达间充质来源的波行蛋白质,而波形蛋白质(vimentin)是一种中间纤维蛋白,由单一多肽链构成。

肾小管上皮细胞在损伤因素的作用下可能转化为肌纤维母细胞而参与间质纤维化,肌成纤维细胞除了表达特征性的α-SMA外,可表达多种中间丝蛋白,如波形蛋白、结蛋白、膜突蛋白和根蛋白以及肌凝蛋白重链[2]。MyoFb来源于成纤维细胞的分化,血管外周围细胞的迁移、局部增殖、小管上皮细胞的转化以及系膜细胞的增殖、转化。TGF-β具有促进成纤维细胞及肾小管上皮细胞发生表型转化、促进细胞外基质分泌增加、促进肾小管上皮细胞凋亡等多方面纤维化相关作用[3],还能促进骨桥蛋白、弹性蛋白等多种物质共同作用促进梗阻性肾病的进展[4]。在肾小球疾病慢性进展过程中,肾间质内表达a-SMA的肌成纤维细胞是肾间质纤维化过程中细胞外基质沉积的最主要的来源[5]。

他汀类药物通过抑制系膜细胞增生,减少TGF-β和胞外基质蛋白分泌、延缓DN进展的作用。本研究通过糖尿病大鼠模型证明,辛伐他汀可能有独立于调脂作用之外抑制TGF-β,可能间接抑制波行蛋白表达,逆转肾小管上皮细胞转分化,但其具体机制尚待进一步阐明。

参考文献

[1] Corsini A,Raiteri M,Soma MR.Pathogenesis of atherosclerosis and the role of 3-hydroxy-3-methyglutary coenzyme A reductase inhibitors[J].Am J Cardiol,2001,6(2):21-32.

[2] Nobrega MA,Fleming S,Roman RJ,et al.Initial characteriation of a rat model diabetic nephropathy [J].Diabetes,2004,53(2):735-742.

[3] Ng YY,Fan JM,Mu,et al.Glomerrular epithelial-myofibroblast transdifferentiation in the evution glomerular crescent formantion[J].Nephrol dial Transplant,2002,12(2):26-50.

[4] Sharma K,J in Y,Ziyadeh FN.Neurtralization of TGF-β anti-body attenuates Kidney hypertrophy and the enhanced extracellular matrix gene expression in STZ induced diabetic mice [J].Diabetes,1999,34(3):522-540.

[5] Matsuo S Morita Y,M izuno M,et al.The role of complement in the progress of renal fibrosis[J].Nephrol Dial Transplantation,2000,15(6):53-76.