文心兰ACC氧化酶基因OnACO1克隆与表达分析

摘 要 以文心兰切花品种“黄金2号”（Oncidium Gower Ramsey ‘Gold2’）为材料，通过RT-PCR和RACE技术，从文心兰的花中分离得到了1个ACO基因成员的cDNA，命名为OnACO1（GeneBank登录号为JQ822088）。

中图分类号 Q75 文献标识码 A

Cloning and Expression Analysis of OnACO1 Gene in Oncidium

YANG Guanghua1，2，LIU Jinping1*

1 Key Laboratory of Protection and Development Utilization of Tropical Crop Germplasm Resources，

Hainan University， Ministry of Education/College of Agronomy， Hainan University， Haikou， Hainan 570228，China

2 Sanya Science &Technology Academy for Crop Winter Multiplication， Sanya， Hainan 572000，China

Abstract A member of ACO gene family， OnACO1（GeneBank accession number JQ822088） was cloned from Oncidium Gower Ramsey ‘Gold2‘ by RT-PCR and RACE technology. The full length cDNA is 1 424 bp with an ORF of 972 bp encoding 324 amino acids， a 172 bp 5′-UTR and a 280 bp 3′-UTR. The deduced amino acid sequence of OnACO1 shares high homology with those of other orchid species. Vector pGEX-OnACO1 was constructed and transformed into E. coli BL21. Prokaryotic expression and SDS-PAGE indicated that a specific band of OnACO1 expression was in consistent with the predicted protein size. Quantitative PCR analysis showed there was a tissue-specific pattern of OnACO1 expression， mainly in gynostemium， and the expression was upregulated by ethylene.

Key words Oncidium；OnACO1；RACE；Gene cloning；Expression analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.04.014

文心兰（Oncidium）又名舞女兰、跳舞兰、金蝶兰、瘤瓣兰，因其花色鲜黄，花型别致，花姿优美，是世界上重要的切花品种，具有较高的观赏价值。栽培的文心兰切花品种以黄色、多花性、中花型的切花品种——南茜（Oncidium Gower Ramsey）及其变异种为主[1]。随温度和季节不同，文心兰切花寿命在1周左右。花朵衰老快慢和寿命长短是评价观花植物品质好坏的一个重要指标，对其进行研究有重要的理论价值和实践意义。

兰科植物花朵的衰老过程为典型的呼吸跃变型，乙烯是主要的调控因子[2]。乙烯合成途径中ACC氧化酶（ACO）可催化ACC向乙烯转化，为乙烯形成的关键限速因子。鉴于乙烯生物合成相关基因在调控花卉衰老和果品完熟方面的重要意义，采用生物技术寻找与花卉保鲜性能相关的目的基因， 从遗传物质上进行改造，对从根本上解决花卉保鲜及抗衰老问题具有重要意义[3]。迄今为止，已在康乃馨[4-9]、百合[10-12]、蝴蝶兰[13]等花卉中进行ACO基因克隆及基因转化研究。本研究对文心兰切花品种‘黄金2号’ACC氧化酶基因的全长cDNA进行克隆和表达分析。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

1.1.1 材料来源 文心兰“黄金2号”（Oncidium Gower Ramsey ‘Gold2’）购自海南博大兰花公司。

1.1.2 材料处理 摘取文心兰的根、茎、叶和花朵，用液氮研磨，于-80 ℃超低温冰箱中保存备用；用乙烯利涂抹文心兰花部，并套袋处理一定时间，取文心兰的唇瓣、花瓣、花萼和蕊柱同样用液氮研磨，于-80 ℃保存备用。

1.1.3 质粒及菌株 克隆载体pMD18-T Vector购自Takara公司。E.coli DH5α、BL21以及表达载体质粒pGEX-6P-1由中国热带农业科学院生物技术研究所彭世清课题组惠赠。

1.1.4 主要生化试剂 反转录试剂盒RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis kit、限制性内切酶FastDigest Bam HI和FastDigest Sal Ⅰ购自Fermentas公司，3′-full RACE Core Set、5′-full RACE Core Set、Taq DNA聚合酶、PrimeScript RT reagent Kit、SYBR Premix Ex Taq、DL 2 000 DNA Marker均购自Takara公司，ACC购于OMEGA公司。其他生化试剂和常规试剂均为超纯和分析纯。

1.1.5 引物 实验中所设计的引物（表1）全部委托上海英骏生物技术有限公司（Invitrogen）合成。

1.2 方法

1.2.1 文心兰总RNA的提取及反转录 采取CTAB法[14]分别提取文心兰的根、假鳞茎、叶、唇瓣、花瓣、花萼、蕊柱的总RNA，经电泳检测条带完整无降解。以反转录的第一链cDNA为模板，进行actin引物扩增检测。

1.2.2 OnACO1克隆与序列分析 （1）OnACO1克隆：①采用改良CTAB法提取文心兰花部总 RNA，电泳检测其完整性后参照反转录试剂盒RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis kit（Fermentas）的操作说明合成第一链cDNA，扩增actin基因检测cDNA第一链的反转录效果。②根据GeneBank上已登录的石斛兰（AF038840）、卡特兰（AY598793）、蝴蝶兰（AF004662）等兰科植物ACO氨基酸的保守区域设计一对简并引物ACO-1和ACO-2，以第一链 cDNA为模板，进行目的基因的中间片段PCR扩增。③将获得的DNA片段连接到pMD18-T Vector，转化感受态细胞E.coli DH5α，以LB/Amp平板培养后进行蓝白斑筛选，挑取白色菌落进行M13菌落PCR鉴定。④将鉴定的阳性克隆送Invitrogen公司测序。

（2）序列分析：①根据所获得的保守序列测序结果分别设计3′-RACE特异引物ACO P31、ACO P32和5′-RACE特异引物ACO P51、ACO P52，并结合试剂盒中的两端引物，参照Takara公司的3′-full RACE Core Set、5′-full RACE Core Set的操作说明，以cDNA为模板，通过巢式PCR的方法扩增OnACO1基因的3′和5′末端。②PCR产物经回收、连接、转化、鉴定后委托Invitrogen公司测序。③将中间片段、3′末端和5′末端的测序结果提交NCBI（http：//.cn/qkpdf/rdxb/rdxb201404/rdxb20140414-1.pdf" style="color:red" target="_blank">原版全文

2.4 OnACO1基因的表达分析

以根部的表达量为参照，OnACO1在文心兰蕊柱中的表达量最高，其次是花瓣和花萼，唇瓣、根、茎和叶中的表达量均很低（图6）。用1%的乙烯利各处理文心兰花部0、6、12、24、48 h，摘取蕊柱，分别提取总RNA并将其反转录成cDNA，以Actin作为内参，进行荧光定量PCR。结果表明用乙烯利对文心兰进行处理后，蕊柱中OnACO1基因的表达在处理24 h时上调效果比较明显（图7）。

3 讨论与结论

目前植物基因克隆的方法比较多，本研究采用了同源克隆结合RACE的方法扩增目的基因的全长cDNA，但其在实际操作中存在不少的困难：（1）简并引物是多序列的混合物，由于其序列的不确定性，引物的特异性必然会降低，反应底物的溶度和退火温度就必须经过多次摸索。史兆兴等[17]在反应条件的优化中，总结出在起先的4～5个循环中设置低于常规温度5～10 ℃的退火温度，在随后的循环中再提高到正常的退火温度，这样有利于简并PCR的进行。本研究在利用简并引物扩增ACS基因的中间目的片段时，采用特定的退火温度进行PCR难以取得理想的效果，因此在对PCR条件的优化实验中，先进行了5个循环的低温退火，然后再进行30个循环的高温退火，扩增出了较好的目的条带。（2）5′ RACE中3个连续的酶促反应（反转录，TdT加尾和PCR扩增）每一步都可能导致实验的失败；即使酶促反应顺利，也容易产生大量的非特异性扩增。邓雪柯等[18]比较优化3种RACE法（环化法、末端脱氧核糖核酸转移酶法和SMART反转录酶法）的扩增效果，结果表明RACE技术能较好地解决非特异性扩增和错配等问题，但其对RNA的质量有更高的要求。本研究选用Takara公司的3′-full RACE Core Set和5′-full RACE Core Set进行巢式PCR，电泳显示几乎没有非特异性扩增，获得比较单一的目的条带。

在已有报道的基因中，ACO基因具有920～990 bp的开放阅读框，编码大约320个氨基酸，其中石斛兰ACO基因（ABK32881）编码324个氨基酸，卡特兰ACO基因（BAF36562）编码324个氨基酸。文心兰OnACO1基因有972 bp的开发阅读框，经Blast比对后，OnACO1基因序列与卡特兰、石斛兰、蝴蝶兰的ACO序列同源性分别达88%、86%、86%。这些结果表明本研究克隆出的文心兰OnACO1基因是ACO基因家族中的典型成员。

荧光定量PCR结果表明OnACO1基因主要在蕊柱中表达，而在其他组织中基本不表达，这与张宪省等[19-21]研究的蝴蝶兰表达模式具有一致性。在用乙烯利处理文心兰蕊柱和花萼的实验中，分别以未被处理的文心兰蕊柱和花萼为对照，乙烯利对OnACO1基因的表达起到了上调作用。这些都表明OnACO1基因可能在文心兰花衰老中发挥重要作用。

ACC氧化酶基因是多基因家族[22-23]，同一基因家族中不同基因的表达模式可能会有很大的差别。本研究只分析了ACO基因家族中的一个基因，目前正在克隆ACO基因家族的其他成员，今后将对ACO基因在文心兰切花衰老调控中的表达变化和功能进行深入探讨。

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