重组血管紧张素转化酶抑制肽工程菌细胞破碎条件优化

摘要： 以重组血管紧张素转化酶抑制肽（ＡＣＥＩＰ）工程菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ｐＧＥＸ－４Ｔ－２－ＡＨＰ）破碎率、破碎液中目的融合蛋白浓度（ＧＳＴ－ＡＨＰ）为主要考察指标，对重组血管紧张素抑制肽工程菌破碎条件进行了优化。结果表明，其最佳工艺条件为每克湿菌体重悬于３ ｍＬ含有２ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ的１×ＰＢＳ缓冲液中，加溶菌酶至终浓度２０ ０００ Ｕ／ｍＬ，室温放置３０ ｍｉｎ后超声破碎３０ ｍｉｎ，４ ℃ １０ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ取上清液。在此最佳工艺条件下破碎液中可溶性ＧＳＴ－ＡＨＰ浓度达到１．８３ ｇ／Ｌ。

关键词：重组血管紧张素转化酶抑制肽（ＡＣＥＩＰ）；工程菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ｐＧＥＸ－４Ｔ－２－ＡＨＰ）；破碎条件

中图分类号：ＴＱ９２５文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０14）09－2127-03

Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ－Ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｓｔｒａｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１

ＬＩ Ｙａｎ，ＳＵＮ Ｈａｉ－ｙａｎ，ＺＨＯＵ Ｌｉ－ｚｈｅｎ，ＬＩＵ Ｄｏｎｇ

（Ｓｈｅｎｚｈｅｎ Ｐｏｌｙｔｅｃｎｉｃ／Ｓｈｅｎｚｈｅｎ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ ５１８０５５，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂａｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｃｅｌｌ－ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎs ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ， Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ｐＧＥＸ－４Ｔ－２－ＡＨＰ） ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｐｅｐｔｉｄｅ ｗere ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ using ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ ｒａｔｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＧＳＴ－ＡＨＰ） ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｓ ｉｎｄｉｃｅｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍal ｃｅｌｌ－ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ ｗａｓ ｓｕｓｐｅｎｄing ｐｅｌｌｅｔ ｉｎ ３ ｍＬ ｏｆ １×ＰＢＳ ｗｉｔｈ ２ ｍｍｏｌ／ｍＬ ＥＤＴＡ ｐｅｒ ｇ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌｓ， ａｄｄing ｌｙｓｏｚｙｍｅ ｔｏ ２０ ０００ Ｕ／ｍＬ ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ ｂｙ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ３０ ｍｉｎ ａｆｔｅｒ ｓｔｏｒｅｄ ａｔ ａｍｂｉｅｎｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｆｏｒ ３０ ｍｉｎ， taking ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ａｆｔｅｒ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ ａｔ １０ ０００ ｒ／ｍｉｎ ｆｏｒ １０ ｍｉｎ ａｔ ４ °Ｃ． Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅｓｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＧＳＴ－ＡＨＰ ｉｎ ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗａｓ １．８３ ｇ／Ｌ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｐｅｐｔｉｄｅ； ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ； ｃｅｌｌ－ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ

血管紧张素转化酶抑制肽（ＡＣＥＩＰ）是一类通过抑制血管紧张素转化酶活性从而达到降低血压的小分子多肽，具有降压效果明显、无毒副作用等特点［１－４］。ＡＣＥＩＰ可通过特异性酶解从天然动植物和微生物蛋白中提取，但由于天然蛋白中ＡＣＥＩＰ含量很低，因而产率低、成本高，难以产业化。化学合成方法可以按照人们的意愿合成制备任意活性的ＡＣＥＩＰ，但大都因成本高、副反应物多及化合物残留等问题制约其产业化发展。近年来利用微生物基因工程技术生产蛋白质多肽药物和食品原料由于具有表达高效、产量高、成本低等优点而越来越得到广泛应用。

本研究通过分析ＡＣＥＩＰ结构与降血压活性之间的关系，设计出高活性的ＡＣＥＩＰ单体，并利用基因工程手段克隆到大肠杆菌融合表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－２之上，构建了能高效稳定表达ＡＣＥＩＰ的基因工程菌Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ｐＧＥＸ－４Ｔ－２－ＡＨＰ）［５］。由于该工程菌表达的ＡＣＥＩＰ属胞内表达，因而如何通过经济高效的细胞破碎工艺将胞内表达的ＡＣＥＩＰ溶出成为ＡＣＥＩＰ分离纯化的关键步骤之一［６］。因此，本研究以细胞破碎率、破碎液中目的融合蛋白浓度为主要考察指标，对构建的基因工程菌的细胞破碎条件进行了优化。研究结果将为后续的进一步分离纯化奠定基础。

１材料与方法

１．１材料与仪器

基因工程菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ｐＧＥＸ－４Ｔ－２－ＡＨＰ）自制；二硫苏糖醇（ＤＴＴ），加拿大ＢＢＩ分装，超纯；三羟甲基氨基甲烷（Ｔｒｉｓ）、甘氨酸、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、溶菌酶（ｌｙｓｏｚｙｍｅ， ２０ ０００ Ｕ／ｍｇ），加拿大ＢＢＩ公司产品；丙烯酰胺、亚甲双丙烯酰胺、Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ，－四甲基乙烯二胺（ＴＥＭＥＤ）、过硫酸胺（ＡＰＳ）、β－ＭＥ（β－巯基乙醇），美国Ａｍｒｅｓｃｏ公司产品；十二烷基磺酸钠（ＳＤＳ）、考马斯亮蓝Ｒ－２５０，Ｆｌｕｋａ产品；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｒｋｅｒ（Ｍ．Ｗ．１４．４～１１６．０ ｋＤａ），购自Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司；ＢＣＡ蛋白检测试剂盒，购自Ｐｉｅｒｃｅ公司。

Ｂｉｏｓｔａｔ Ｃ型 ３０ Ｌ发酵罐，德国贝朗公司；垂直电泳槽、ＣＯＮＳＯＲＴ Ｅ８６１型电泳仪，美国ＵＶＰ公司；ＧｅｎｅＧｅｎｉｕｓ凝胶成像系统，Ｓｙｎｇｅｎｅ公司；超声波破碎仪（ＶＣ×６００型），Ｓｏｎｉｃｓ公司；核酸蛋白检测仪，德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司。

１．２试验方法

１．２．１发酵液的制备活化基因工程菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ｐＧＥＸ－４Ｔ－２－ＡＨＰ），通过菌种扩增，再进行高密度发酵。具体操作如下：活化后的基因工程菌按１％接种量转接至１００ ｍＬ含氨苄青霉素（Ａｍｐ）的 ２×ＹＴＡ培养基，３７ ℃、２５０ ｒ／ｍｉｎ培养８ ｈ。再按１０％接种量转接至含２０ Ｌ发酵培养基的３０ Ｌ发酵罐中，控制溶氧４０％，ｐＨ７．０，３７ ℃进行发酵。培养２ ｈ后开始补料，补料速度１ ｍＬ／ｍｉｎ，补料１ ｈ，培养３ ｈ后加入诱导剂诱导６ ｈ，共发酵９ ｈ制得发酵液。

１．２．２目的蛋白含量的测定采用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白电泳法，用凝胶成像系统照相保存，用Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌ软件分析目的融合蛋白（ＧＳＴ－ＡＨＰ）含量。

１．２．３总蛋白含量的测定采用ＢＣＡ法。碱性条件下，蛋白质将Ｃｕ２＋还原为Ｃｕ＋， Ｃｕ＋与ＢＣＡ试剂形成紫颜色的络合物，测定其在５６２ ｎｍ处的吸光度，并与标准曲线对比，即可计算出待测蛋白的浓度。具体操作如下：将标准蛋白牛血清白蛋白（ＢＳＡ）用１×ＰＢＳ稀释成浓度分别为２５、１２５、２５０、５００、１ ０００、１ ５００、２ ０００ μｇ／ｍＬ的标准品溶液，取１００ μＬ不同浓度的标准品溶液加入１ ｍＬ工作液，３７ ℃反应３０ ｍｉｎ，测定ＯＤ５６２ ｎｍ。以蛋白质浓度（μｇ／ｍＬ）为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

１．２．４ＧＳＴ－ＡＨＰ浓度的确定根据“１．２．３”所得总蛋白含量及“１．２．２”所得ＧＳＴ－ＡＨＰ含量计算ＧＳＴ－ＡＨＰ浓度。

１．２．５酶法与反复冻融法相结合破碎菌体发酵液４ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ，弃上清液收集菌体沉淀，用１×ＰＢＳ缓冲液洗涤２次，称重记录湿菌体的质量。按每克湿菌体加３ ｍＬ含有２ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ的 １×ＰＢＳ的比例将菌体沉淀重悬，加溶菌酶至终浓度２０ ０００ Ｕ／ｍＬ，冰浴３０ ｍｉｎ后，－７０ ℃冷冻、２５ ℃水浴消融，反复冻融８次。每冻融１次，镜检计算破碎率；同时取１ ｍＬ 细胞裂解液，用针筒将２０％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００强行注入黏的细胞裂解液中至终浓度为１％，温和混合３０ ｍｉｎ后，加入ＤＮａｓｅ和ＲＮａｓｅ至终浓度为５ μｇ／ｍＬ，４ ℃振荡１０ ｍｉｎ。１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ收集上清液，取１０ μＬ上清液进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳，用Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌ分析，比较不同冻融次数对ＧＳＴ－ＡＨＰ浓度的影响。

１．２．６酶法与超声波法相结合破碎菌体按每克湿菌体加３ ｍＬ含有２ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ的 １×ＰＢＳ的比例将菌体沉淀重悬，加溶菌酶至终浓度２０ ０００ Ｕ／ｍＬ，室温放置３０ ｍｉｎ。取２００ ｍＬ酶解液超声波破碎，每破碎５ ｍｉｎ取样１次，镜检计算破碎率；同时取样１ ｍＬ，离心收集上清液取１０ μＬ上样进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳检测，用Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌ分析，比较不同超声时间对ＧＳＴ－ＡＨＰ浓度的影响。超声波处理参数：Ф１３ ｍｍ螺纹探头和Ф１３ ｍｍ螺纹探头可换尖端，振幅７５％，开５ ｓ，停５ ｓ。共破碎４０ ｍｉｎ。

２结果与分析

２．１标准曲线的绘制

标准曲线见图１。以蛋白质浓度（μｇ／ｍＬ）为横坐标，以吸光度为纵坐标，得回归方程：ｙ＝０．００１ ３ｘ＋０．０４５ ９，Ｒ２＝０．９９７。

２．２酶法与反复冻融法相结合的破碎条件研究结果

２．２．１冻融次数对菌体破碎率的影响结果见图２。由图２可见，随着冻融次数的增多，菌体破碎率增加，当反复冻融５次时，破碎率已达９０％，６次时即达１００％。

２．２．２冻融次数对ＧＳＴ－ＡＨＰ浓度的影响结果见图３和图４。由图３和图４可见，反复冻融６次时，上清液中ＧＳＴ－ＡＨＰ浓度已达到最大。因此反复冻融的次数确定为６次。此时，上清液中ＧＳＴ－ＡＨＰ浓度达１．８６ ｇ／Ｌ。

２．３酶法和超声波法相结合的破碎条件研究结果

２．３．１超声时间对菌体破碎率的影响结果见图５。由图５可见，随着超声时间的延长，菌体破碎率增加，当超声时间达到３０ ｍｉｎ时，菌体破碎率达到１００％。

２．３．２超声时间对ＧＳＴ－ＡＨＰ浓度的影响结果见图６和图７。由图６和图７可见，超声时间达３０ ｍｉｎ时，上清液中ＧＳＴ－ＡＨＰ浓度达到最大（１．８３ ｇ／Ｌ），超声时间进一步延长，ＧＳＴ－ＡＨＰ浓度不再增加。因此确定超声破碎时间以３０ ｍｉｎ为宜。

２．４两种方法的破碎效果比较

反复冻融６次或超声波破碎３０ ｍｉｎ，细胞破碎率均可达到１００％，此时，上清液中ＧＳＴ－ＡＨＰ浓度达到最大，分别为１．８６和１．８３ ｇ／Ｌ。反复冻融法操作较繁琐，耗时长，需要添加价格昂贵的ＤＮａｓｅ和ＲＮａｓｅ降解ＤＮＡ及ＲＮＡ以降低破碎液黏度，且每次处理量不能太大；而超声波破碎时间短、效率高，且对细胞破碎所释放的ＤＮＡ、ＲＮＡ具有一定剪切作用，破碎同时能有效降低其黏度，综合考虑选择超声波破碎为工程菌细胞破碎条件。

３结论

试验结果表明，重组血管紧张素转化酶抑制肽工程菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ｐＧＥＸ－４Ｔ－２－ＡＨＰ）破碎的最优工艺条件为：每克湿菌体重悬于３ｍＬ含有２ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ的１×ＰＢＳ缓冲液中，加溶菌酶至终浓度为２０ ０００ Ｕ／ｍＬ，室温放置３０ ｍｉｎ后超声波破碎３０ ｍｉｎ，４ ℃ １０ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ取上清液。超声波破碎条件：Ｓｏｎｉｃｓ（ＶＣ×６００型）超声波破碎仪，Ф１３ ｍｍ螺纹探头和Ф１３ ｍｍ螺纹探头可换尖端，振幅７５％，开５ ｓ，停５ ｓ。此条件下上清液中可溶性ＧＳＴ－ＡＨＰ浓度达到１．８３ ｇ／Ｌ。

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