厚朴多酚的提取及体内抗氧化研究

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摘要：抗氧化活性是研究动物抗衰老的重要方面。以厚朴树皮为原料，比较超声波法和浸提法提取厚朴多酚的含量差异，并研究了厚朴多酚对KM小鼠体内抗氧化活性和有害性。结果表明：采用超声波提取法提取得到的多酚纯度为76.67%，高于浸提法（64.11%）；厚朴多酚进行分组对比试验，灌胃饲养试验表明：KM小鼠血清中抑制羟自由基的能力和抗氧化成分（T-SOD、CAT、GSH-Px）的活性都得到提升，而有害的成分丙二醛MDA的含量有所降低。因此，厚朴多酚有抗氧化作用，有可能使动物健康生活，从而达到抗衰老的效果。

关键词：厚朴多酚；KM小鼠；灌胃；血清；活性

中图分类号：R284 文献标识码：A 文章编号：1006-060X（2018）03-0029-04

厚朴（Magnolia officinalis）为我国著名的中药，具有燥湿消痰、下气除满的功效，用于湿滞伤中、脘痞吐泻、食积气滞、腹胀便秘、痰饮喘咳。厚朴树皮具有化湿导滞、下气除满、化食消痰、驱风镇痛等功效；种子有明日益气之功效，芽可作妇科药用，还可以加入癌症药物中。目前，藿香正气丸、开郁顺气丸、香砂养胃丸、润通口服液等常用药中均含有厚朴，其主要有效成分为厚朴酚与和厚朴酚。

厚朴树皮中主要含有木脂素类化合物、挥发油、生物碱等成分。木脂素类化合物是厚朴中分离出的最主要化学成分，迄今为止，已分离出20多种，多数属于新木脂素，主要有厚朴酚与和厚朴酚。厚朴中大约含有1%的挥发油，其中大部分都具有镇静作用，据研究，将提取的厚朴挥发油进行GC-MS研究，分离出了48种成分，按叶油醇及其异构体是主要成分，约占挥发油总量的40%～55%。挥发油普遍存在于树皮、根皮、树叶和花中，但是花与其他部位的挥发油的组分有较大的区别。厚朴树皮中生物碱含量较高，王洪燕等对凹叶厚朴中生物碱的化学成分进行研究，得到9个异喹啉生物碱。除此之外，有学者从厚朴树皮材料中分离出了槲皮苷、芦丁、花生酸、棕榈酮、二十六烷醇、β-谷甾醇、胡萝卜苷。

自由基是人体生命活动中多种生化反应产生的正常代谢产物。在正常情况下，人体内的自由基是处于不断产生与被清除的动态平衡中，自由基是机体有效的防御系统，对维持机体正常代谢有一定促进作用。但是自由基产生地过多或者清除地过慢，就会对人体细胞膜及大分子（如蛋白质、DNA）产生一系列损害，加速机体的衰老过程并诱发各种疾病。因此，一些化学合成的抗氧化剂被广泛用于食品和医药领域。但最近研究表明合成的氧化剂具有各种缺陷，例如BHT、BHA，由于它们会对人体器官造成伤害而遭到禁用。因此，寻找天然高效和低毒性抗氧化剂日益受到关注。而厚朴是我国传统的中草药，在全国制药行业中利用厚朴配方的中成药多达200余种。近年来，一些研究已发现厚朴酚可以保护小肠、脑和后肢的缺血和再灌注损伤。深入研究厚朴多酚的抗氧化作用，可以为进一步研究和开发利用厚朴提供参考。

1材料与方法

1.1试验材料

KM小鼠，厚朴树皮从湖南采购。主要器材：CTXNW-10B超声循环提取机（北京弘祥隆生物技术开发有限公司），功率200w；SHZ-3循环水多用真空泵；药物粉碎机；旋转蒸发仪。主要试剂：没食子酸；DPPH；ABTS；所用的试剂盒均从南京建成生物工程研究所购买，常用试剂均为AR级。

1.2试验方法

1.2.1厚朴类化合物的提取（1）超声波提取法。将烘干后的树皮打碎成厚朴粉，过60目筛。参照李胜华对多穗柯总黄酮的提取工艺设计，称取4 kg的厚朴粉加10倍量的80%乙醇浸泡24 h，超声循环提取50 min，过滤得到粗多酚液，再减压浓缩成浆状，即可获得粗提取液。（2）浸提法。该法由于工艺简便、成本低、纯度高而被广泛使用，但此法提取率低。称取250 g厚朴粉，加10倍量的80%乙醇浸泡。每次搅拌相隔约为8 h，每天搅拌3次，浸泡3 d。过滤得到粗多酚液，再减压浓缩成浆状，即可获得粗提取液。

1.2.2厚朴多酚类化合物的纯化 D-101型大孔树脂先进行预处理，之后装入层析柱，调节好流量1.0 mg/mL。将粗提取液倒入层析柱中，再依次用4L60%和30%的乙醇导入层析柱中进行纯化。将纯化得到的溶液倒入瓷盘中，放入65%烘箱中烘干，再用研钵研碎，即可得到厚朴多酚粉。将粉末放入4℃冰箱中备用。

1.2.3厚朴多酚粉的多酚含量测定 精确称取0.100 g没食子酸标准样品。蒸馏水溶解并定容至1 000 mL。该标准液浓度为0.1 mg/mL。准确量取上述标准液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL于50mL容量瓶中，各加30mL水，摇匀，再加2.5mLFC试剂，充分摇匀。1 min之后，加入碳酸钠溶液（20%）7.5 mL，混匀定容。水浴75℃下反应10min。于760nm波长下比色，测定吸光度，建立标准曲线，得到回归方程（多酚含量以没食子酸等价物表示）。

1.2.4厚朴多酚粉的多酚含量测定 准确称取50mg厚朴多酚粉末于50 mL容量瓶中，配成母液，采用梯度稀释制得100倍稀释液和200倍稀释液，移取1mL稀释液进行测定。用紫外可见分光光度计测得吸光值，将其代入標准曲线回归方程中，获得样品多酚浓度，再按公式（1）计算出多酚的含量。

多酚含量=（样品浓度×样品稀释倍数）/取样量×100% （1）

1.2.5厚朴多酚抗氧化活性试验 （1）KM小鼠选择。试验所用小鼠为体重在30±3g的KM小鼠50只，雌雄各25只，然后进行随机分组。分5组，每组5只雄、5只雌，雌雄分开，用苦味酸分别标记左上肢，右上肢，左下肢，右下肢，背部。（2）灌胃试验。配制20mg/mL的厚朴多酚溶液，灌胃分高剂量组（400mg/kg）、中剂量组（200mg/kg）、低剂量组（100mg/kg）灌胃配制的厚朴多酚溶液，VC对照组用维生素C100 mg/kg剂量灌胃，空白对照组用水100mg/kg剂量灌胃。维生素每次灌胃前半小时配制。每两天称重1次。灌胃两周，然后停止灌胃，休整1d之后取血处死。（3）取样及处理。处死前提前先配制抗凝血剂，实验用的抗凝血剂是柠檬酸钠。试验过程：摘眼珠取血保存并标记。小鼠取血滴加抗凝剂按7：1滴加，当天离心分离血浆，离心用4000 r/min，离心时间6min，标记好置于4℃冰箱临时保存待用.

1.2.6指标测定 用考马斯亮兰测定蛋白；硫代巴比妥酸法测定MDA含量；黄嚓吟氧化酶法测定超氧化物歧化酶（SOD）的活性；DNTB直接比色法测定谷光甘肤过氧化物酶（GSH-px）的活性；可见光比色法测定过氧化氢酶（CAT）的活性。测定试验全部参照试剂盒的使用说明进行。

1.2.7数据处理 通过SPSS19.0软件系统计算均值、标准差，动物试验部分的相应数据用x±s表示，并用配对t检验和两样本均数比较t检验检测其显著性。

2结果与分析

2.1厚朴多酚粉的多酚含量测定

以没食子酸溶液的浓度为横坐标，没食子酸不同浓度的溶液所对应的吸光值为纵坐标绘制没食子酸标准曲线（图1），得到没食子酸标准曲线回归方程为：y=89.179x-0.000 8，R²=0.9994，其中x：没食子酸等价物质量浓度（mg/mL）；y：溶液在510mm处吸光值。厚朴多酚粉的吸光值及多酚含量如表1所示。

由表1可知，两种方法提取厚朴多酚得到的纯化物的含量均较高，超声波提取法（76.67%）明显优于浸提法（64.11%）。因此，试验选取用超声波提取法得到的纯化物作为体内抗氧化的试验材料。

2.2血清中蛋白含量测定

由表2可知，不同灌胃组之间的蛋白含量均达到了85 g/L，各组间蛋白含量没有显著差异（P>0.05），说明厚朴多酚对于小鼠血浆中的蛋白含量没有显著影响。

2.3抑制羟自由基能力的测定

用生理盐水将血清（浆）按1：1、1：4、1：9、1：19、1：49、1：99等稀释成一系列不同浓度的血浆，分别取不同浓度的血浆0.2 mL按血清的测定操作表进行检测。

根据表3的试验结果，并结合试剂盒要求抑制率在45%～55%效果最为理想，此次的试验稀释20倍时的抑制率在47.14%，符合要求，因此羟自由基测定试验采用20倍稀释液进行。经过预试验，确定好了血浆样品稀释倍数，经稀释后，采用上述相同方法进行试验，羟自由基测定的结果见表4。

由表4可知，灌胃不同剂量厚朴多酚呈现的抑制羟自由基的能力差异显著（P<0.05），同时从抑制率可以看出高剂量组（55.83%）>中剂量组（46.78%）>低剂量组（45.59%）>空白对照组（45.20%），说明厚朴多酚对小鼠的药理作用中，厚朴多酚的量与血浆中抑制羟自由基的能力成正相关。对比VC对照组可以看出，厚朴多酚对小鼠的有同样的药理作用，提高血浆中抑制羟自由基的活力；但低剂量组与VC组的对比表明，相同剂量的厚朴多酚的作用不如VC。试验结果表明，厚朴多酚类化合物增强了小鼠血清中抑制羟自由基的能力。这一结果与之前的许多研究结果是一致的。

2.4厚朴多酚类化合物对丙二醛（MDA）的影响

在脂质过氧化过程中，MDA是重要代谢产物之一，是由细胞膜上的不饱和脂肪酸在受到辐射和OH直接作用时产生的。因此，MDA的数量变化可表示脂质过氧化的程度，是判断自由基损伤的重要指标之一。

由表5可知，高剂量组、中剂量组以及VC对照组的MDA含量与空白对照相比，存在显著性差异（P<0.05），只有低剂量组没有显著性差异。因此可以认为厚朴多酚是有作用的。MDA的含量随灌胃剂量的增加而减小，两者之间存在一定的负相关性。此外，厚朴多酚中剂量组就达到了VC对照组中灌胃剂量100mg/kg的效果。由此表明：厚朴多酚类化合物有很好的抗氧化性。

2.5厚朴多酚类化合物对总超氧化物歧化酶（T-SOD）活性的影响

SOD作为体内重要的抗氧化酶，主要是清除超氧阴离子自由基，若生物体内SOD活力下降，就会引起脂质过氧化反应，会对生物体造成很大的损伤。SOD对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少。

由表6可知，低剂量组与空白对照组没有显著性差异，但是其他组均存在显著性差异（P<0.05）。因此可以认为厚朴多酚类化合物还是有提高SOD活力的作用的。此外，SOD活力随灌胃剂量的增加而上升，两者之间存在一定的正相关性。低剂量组与VC对照组相比，可以认为VC对维持生物体SOD活力更佳。

2.6厚朴多酚类化合物对过氧化氢酶（CAT）活性的影响

由表7可知，中剂量组、高剂量组以及VC对照组与空白对照有显著性差异（P<0.05）；高剂量组的活力大于中剂量组和低剂量组。灌胃剂量与活力数值呈正相关性，该结果与抑制羟自由基的能力得出的结论起到了相互补充的作用，而且两者得出的结论相符。因此可以得出：厚朴多酚类化合物有起到体内抗氧化作用。

2.7厚朴多酚类化合物对谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性的影响

GSH-PX是体内重要的抗氧化酶，主要是清除体内过氧化氢和有机氢过氧化物，并能够特异地催化还原型谷胱甘肽对过氧化氢的还原反应，起到保护细胞膜结构和功能完整的作用。由表8可知，高剂量组、中剂量组以及VC对照组的谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性比空白对照显著提升（P<0.05）。对GSH-PX活力的影響可能是厚朴多酚类化合物自身发生化学反应，然后出现带有电荷基团，它们与过氧化氢以及有机氢过氧化物反应，从而降低机体被氧化的风险，增强机体的抗氧化能力。也可能是因为厚朴多酚在机体内刺激了谷胱甘肽过氧化物酶的生成，使体内谷胱甘肽过氧化物酶含量增加，从而可以促进过氧化氢与GSH反应生成水及氧化型谷胱甘肽（GSSH），因此消耗掉机体内的过氧化物。

3结论与讨论

厚朴多酚类化合物的提取采用了超声波提取法与浸提法，两种方法所获纯化物的多酚含量分别是76.67%和64.11%。因此试验中采用了超声波法提取厚朴多酚类化合物。

以KM小鼠为试验材料进行体内抗氧化试验，结果表明：一方面，KM小鼠血清中的蛋白含量比较接近，同时抑制羟自由基的能力和抗氧化活性成分（T-SOD、CAT、GSH-Px）的活性都有提升，说明KM小鼠的蛋白抗氧化能力得到了增强。另一方面，有害的成分（MDA）的含量有所降低，这有可能利于小鼠健康生长。由此可见，厚朴多酚类化合物具有抗氧化性作用，并可能使动物更健康生活，从而达到抗衰老的效果。