大果山楂多糖的分离纯化与结构的初步分析

摘 要：本研究采用水提醇沉法、超声波提取法和微波提取法3种方法提取信宜大果山楂中的多糖成分，用正交法優化工艺。其中，水提醇沉法效率最高，多糖的提取率可达9.73%。大果山楂粗多糖经过脱蛋白和透析处理后，用Sephadex G-75凝胶柱层析纯化，得到单一组分，该组分有单一的示差峰和一个显著的紫外吸收峰，且保留时间基本一致，推测该组分是糖蛋白复合物。对该组分进行红外光谱分析，具有多糖和蛋白质的特征吸收峰，初步确定多糖结构是β型吡喃糖苷键构型。

关键词：大果山楂；多糖；分离纯化；凝胶柱层析；红外光谱

Abstract：In this study， three different methods are used to extract polysaccharides from the fruit of malus doumeri： hot water extraction， ultrasonic extraction and microwave extraction. The parameters are optimized by orthogonal analysis. Among the 3 methods， hot water extraction has the highest efficiency， the extraction rate of polysaccharides can reach 9.73%. The crude extract was subsequently purified by sevage method and dialysis， followed by a Sephadex G-75 gel chromatography. The result showed a single differential peak and a significant UV absorption peak simultaneously， indicating a glycoprotein complex. Infrared spectrograph yields characteristic absorption peak of polysaccharide and protein， and indicates a beta-pyranoside configuration of the polysaccharide sample.

Key words：Malus doumeri； Polysaccharide； Purification； Gel chromatography； Infrared spectrograph

中图分类号：TS255.36

1 研究背景

大果山楂是蔷薇科苹果属植物台湾林檎[Malus doumeri （Bois）Chev.]的干燥成熟果实，又名南山楂、广山楂等。大果山楂广泛分布于我国华南地区和台湾省，以及越南等地，其果实性味甘、酸、涩、微温，有理气健脾、消食导滞的功能[1]。还含有多种有机酸、类黄酮和萜类等天然活性成分，有降低血压、降低胆固醇、抑制心脑血管疾病的作用[2]。大果山楂一般作水果食用，切片晒干后可入药。目前，市场上的山楂制品有山楂饼、山楂片、山楂糕等干湿果点，还有果汁、果酒、果酱等加工品。

多糖又称多聚糖，是由20多个乃至上万个单糖以糖苷键结合而成的天然高分子化合物。它广泛存在于植物、动物和微生物组织中，是除核酸和蛋白质以外的一类重要生物大分子。根据多糖的结构与生理活性，可将其分为淀粉系多糖和非淀粉系多糖，后者往往有一定的临床活性，如抗病毒、抗肿瘤、抗衰老、降血糖等，具备开发为药品和保健品的潜力，又称“功能多糖”。多糖多种多样的生物活性与其分子量、结构、溶解度等有关，因此多糖结构信息的发掘对其功效研究起着至关重要的作用。

大果山楂资源丰富，富含多种活性成分，目前已有的研究主要针对类黄酮[3]、有机酸[4]、萜类[5]等物质，对于大果山楂的多糖成分，尚未见相关研究报道。本研究目的是提取和纯化大果山楂中的多糖成分，确定最佳工艺，进一步确定其多糖的组成，为多糖类物质的研究和大果山楂保健品的开发提供参考。

2 材料与方法

2.1 材料

原料：信宜大果山楂，购自信宜钱排镇农贸市场。取新鲜果肉切块后烘箱干燥、粉碎，4 ℃冷藏备用。

2.2 多糖的粗提取

2.2.1 水提醇沉法

称取5 g大果山楂粉末，溶于蒸馏水中恒温加热一段时间，过滤取滤液，60 ℃真空旋转浓缩，浓缩液加入3倍体积的95%乙醇在4 ℃下醇沉24 h，离心，沉淀依次用无水乙醇、丙酮洗涤，置于恒温干燥箱中烘干，得到大果山楂多糖粗品。

本实验参考黄欣欣[6]的研究，选择提取温度、提取时间、料液比3个因素进行正交试验设计，每个因素各取3个水平。见表1。

2.2.2 超声波提取法

称取5 g的大果山楂粉末，溶于蒸馏水中，不同的温度、时间、超声功率处理，过滤取滤液，后续操作同水提醇沉法。

参考卫强[7]超声提取垂丝海棠多糖工艺，选择提取温度、超声时间、料液比、超声功率4个因素进行正交法设计实验，每个因素各取3个水平，见表2。

2.2.3 微波提取法

称取切碎的大果山楂新鲜果肉30 g，加入适量蒸馏水，置于微波炉中，在选定的微波功率、料液比和时间下，进行微波提取，过滤得滤液，后续操作同水提醇沉法。

参考李艳红[8]微波法提取山楂多糖工艺，选取微波时间、微波功率和料液比3个因素设计正交实验，见表3。

2.3 多糖的纯化

2.3.1 Sevage法

取1 g粗多糖溶解于蒸馏水中，定容至100 mL。取50 mL多糖溶液，加入10 mL氯仿和2 mL正丁醇，室温下剧烈摇匀30 min，4 000 r/min离心10 min，去除下层有机相与蛋白质，取上层溶液，重复3～5次。

2.3.2 透析法

将经脱蛋白后的多糖溶液装入处理好的透析袋（截留分子量约8 000）中，自来水透析24 h，然后蒸馏水反复透析48 h，以除去单糖等小分子杂质。

2.3.3 干燥处理

经纯化后的多糖溶液进行浓缩、醇沉24 h，依次用无水乙醇、丙酮洗涤，真空干燥得多糖半纯品。

2.3.4 Sephadex凝胶柱层析

本实验用Sephadex G-75凝胶层析柱对多糖半纯品进一步分离，用PS系列全自动多糖纯化系统（苏州利穗科技有限公司）同时进行紫外与示差检测。

取多糖半纯品0.1 g溶于20 mL蒸馏水中。取5 mL多糖溶液上样，以蒸馏水为洗脱液，流速为0.5 mL/min，用示差检测器检测多糖信号，紫外检测器检测蛋白信号，流分于自动收集器上按每管5 mL收集，合并洗脱单峰，浓缩干燥得多糖纯品。

2.4 多糖含量的测定与计算

本研究采用改良的苯酚-硫酸法[9]测定多糖含量。首先测定系列浓度葡萄糖标准溶液的吸光度，绘制葡萄糖标准曲线，计算出回归方程。

准确称取20 mg多糖粗品溶于水，定容于250 mL容量瓶中，按上述方法测定吸光度，用标准曲线计算糖含量。

式（1）中：C为多糖浓度，mg/mL；m为多糖粗品含量，g；M为大果山楂样品质量，g。

2.5 多糖结构的红外光谱分析

称取大果山楂多糖纯品1 mg，与100 mg KBr混于研钵中，研磨压片，在4 000～400 cm-1进行红外光谱扫描。

3 结果与分析

3.1 大果山楂多糖最优提取工艺

（1）采用改良的苯酚硫酸法测定大果山楂多糖含量，绘制葡萄糖标准曲线，得线性回归方程为：

y=2.137 1x-0.017 5，R2=0.968 7

（2）用水提醇沉法提取大果山楂多糖的最佳工艺：提取温度80 ℃，提取时间4 h，料液比1∶15；得率9.73%。

（3）超声波提取法的最佳工艺：温度80 ℃，料液比1∶10，超声时间10 min，功率150 W，得率3.95%。

（4）微波提取法的最佳工艺：微波功率700 W，微波时间30 min，料液比1∶15，得率0.82%。该工艺必须使用鲜果肉进行多糖的提取，因此得率较低。

（5）3种方法相比较，水提醇沉法提取率工艺简单、条件温和、得率高，但时间较长、能耗较高；超声波提取时间短、能耗低，但对大分子的结构和活性可能造成一定的损坏；微波提取法得率最低，且不能处理干燥后的果肉，实际应用价值较低。

3.2 大果山楂多糖结构的初步分析

3.2.1 Sephadex柱层析实验结果

如图1、2所示，大果山楂多糖经过Sephadex G-75凝胶柱纯化后，示差检测得到单个洗脱峰，紫外检测同时也得到3个蛋白质洗脱峰，其中第一个峰出现时间基本与示差峰一致，说明本实验分离得到的多糖很可能是一种糖蛋白复合物。根据峰出现时间收集组分，浓缩干燥得到多糖纯品，用红外光谱进一步分析其结构。

3.2.2 红外光谱实验结果

大果山楂多糖纯品的红外光谱吸收峰图见图3。图3中3 422.93、2 931.75、1 445.077 cm-1的吸收峰是多糖的特征吸收峰，其中3 422.93 cm-1宽吸收峰是-OH伸缩振动，2 931.75 cm-1为-CH2、-CH3的伸缩振动。图3中1 018.72 cm-1的吸收峰是蛋白质的特征吸收峰，进一步确认该物质是多糖-蛋白复合物。1 749.39、

1 629.21 cm-1为C=C、C=O的振动；1 400～1 200 cm-1有很多不太尖的吸收峰，可能是C-H变角振动峰；1 105.49 cm-1附近有很多吸收峰，是糖类中C-O伸缩振动引起的，说明可能含有吡喃环C-O-C结构或者酸性-COOH基团；819.57 cm-1处吸收峰是甘露糖糖苷键的变角振动，925.27 cm-1有特征吸收峰，说明是β型吡喃糖苷键构型。

4 结论与展望

本试验以信宜大果山楂果实为原料，对其多糖提取工艺、分离纯化和结构分析进行了研究，结论如下：

（1）分别采用水提醇沉法、超声波提取法和微波提取法来提取大果山楂的多糖成分，正交法分析最优工艺条件。实验表明，水提醇沉法的最佳工艺为提取温度80 ℃，提取时间4 h，料液比为1∶15；超声波提取最佳工艺为温度80 ℃，料液比1∶10，超声时间10 min，功率150 W；而微波提取的最佳工艺则为功率700 W，微波时间30 min，料液比1∶15。其中水提醇沉法效率最高，多糖提取率达9.73%，且方法简单、工艺条件温和。

（2）用Sephadex G-75层析柱纯化大果山楂粗多糖，示差和紫外同时检测，分别得到一个对称的洗脱峰，且两个峰的保留时间一致，说明得到的多糖可能是一个糖蛋白复合物。取柱层析纯化产物进行红外光谱分析，显示其具备多糖和蛋白质的特征吸收峰，并且具有β型吡喃糖苷键构型。

5 展望

多糖的研究范围非常广泛，本文在有限时间内进行了一些基本的研究，综合考虑试验结果与实验中遇到的问题，对未来的研究作如下几方面的展望：①基于水提醇沉法优化提取条件，进一步提高提取率。②优化纯化方法，提高多糖的回收率。③利用单糖组分分析法、HPLC、GC-MS等试验方法确定多糖的单糖组分及其高级结构。④研究大果山楂多糖可能具有的生理生化活性及其临床机制，为保健产品的研制提供理论依据。

参考文献：

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[2]何文明，茬瑞林.大果山楂的开发利用[J].中国林副特产，1989（2）：18-19.

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[5]陈 勇，甄汉深，董 艺.广山楂及其叶质量分析研究[J].时珍国医国药，1999，10（7）：511-513.

[6]黄欣欣.大果山楂黄酮类物质的提取及其抗氧化性和降血脂功能研究[D].南宁：广西大学，2015.

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[8]李艳红.山楂多糖的提取、分离纯化及结构分析[D].太原：山西大学，2006.

[9]徐光域，颜 军，郭晓强，等.硫酸-苯酚定糖法的改进与初步应用[J].食品科学，2005，26（8）：342-345.