红芪多糖HPS1—D的化学结构和抗补体活性研究

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[摘要] 目的：红芪多糖HPS1-D的化学结构、初步构象和抗补体活性的研究。方法：红芪经水提醇沉法提取、Sevage法脱蛋白、H₂O₂脱色素、SephadexG-100色谱柱分离纯化得到均一的红芪多糖HPS1-D。以GC、高效液相凝胶色谱法（HPLC-GPC）、凝胶渗透色谱-多角度激光散射仪联用法（GPC-MALLS）、元素分析、苯酚硫酸法、Bradford法、硫酸咔唑法研究其理化性质；采用甲基化、部分酸水解、以及NMR研究其连接方式、主链和支链结构及分支点状况；以GPC-MALLS、对其构象进行初步分析；采用细胞溶血法对其抗补体活性进行研究。结果：HPS1-D主要由葡萄糖和阿拉伯糖组成，主链骨架由1，4和1，4，6-α-D-Glcp，侧链分支位于葡萄糖6位；侧链分支主要由1，5和1，3，5-α-L-Araf 组成；相对分子质量为5.2×10⁵，在0.9% NaCl溶液中为无规则线团；抗补体实验表明HPS1-D有一定程度的抗补体活性，并呈一定的剂量效应关系。结论：HPS1-D为1种新的中性红芪杂多糖，具有一定的抗补体活性。

[关键词] 红芪；多糖；结构；构象；抗补体

[收稿日期] 2013-09-05

[基金项目] 国家“十二五”科技支撑计划项目（2011BAI05B02）

[通信作者] *封士兰，教授，Tel： 13993162172， Fax： （0931） 8915686，E-mail： fengshl@lzu.edu.cn

[作者简介] 杨涛，硕士研究生，Tel：13919025203 红芪系豆科岩黄芪属植物多序岩黄芪Hedysarum polybotrys Hand. -Mazz的根，为甘肃特产名贵药材，在中医理论中红芪用于气虚乏力，食少便溏，中气下陷，久泻脱肛，便血崩漏，表虚自汗，气虚水肿，痈疽难溃，血虚萎黄，内热消渴[1]等。多糖做为红芪的主要活性成分有着特殊的生物活性，目前各种研究显示红芪多糖具有抗癌、抗衰老、抗氧化、抗肿瘤、降血糖、增强免疫力等功效[2-7]。研究表明，一些多糖还具有抗补体的作用，能够抑制补体系统过度活化引发的炎症和损伤[8]。关于红芪多糖的抗补体活性研究未见报道。本实验从红芪多糖HPS1中分离出一种均一组分，对其结构和抗补体活性进行了研究。

1 材料

BP211D 型与BS224S 型电子天平（德国Sartorius 公司）；UV-1700紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）；DHG-9075A 型电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒）；KQ-3200DE 超声波仪器（江苏昆山公司）；BS-100N 自动部分收集器，BT100N数显恒流泵（上海青浦沪西仪器厂）。CR22GⅡ离心机（日本日立）；Freezone 6PWS 型真空冷冻干燥仪（美国LABCONCO）；透析袋（截留相对分子质量3500，美国科技发展公司）；multi EA 4000 元素分析仪（德国Elementar Analysensysteme 公司）；Dawn HeleosⅡ型十八角度激光散射仪（美国怀雅特技术公司）；Waters 600 高效液相色谱仪（美国Waters 公司）UltrahydrogelTM 1000，500 色谱柱（美国Waters 公司）；GC 2014 型气相色谱仪（日本岛津公司）；GC-450， MS-320（美国Varian 公司）；OV-101毛细管色谱柱（兰州中科安泰分析科技有限责任公司）；600 MHz Inova 600 NB 核磁共振波谱仪（德国Bruker 公司）；Well scan MK3 型酶标仪（Thermo Labsystems 公司，芬兰）。单糖对照品：葡萄糖（ Glc， Service 公司） 、甘露糖（Man， Dr. Ehrentorfer 公司） 、木糖（Xyl） 、半乳糖（Gal）为BioSharp 公司产品、鼠李糖（Rha）等为国产AR级。溶血素1∶4 000 Sigma 公司（ 美国）；三氟乙酸（TFA）与二甲基亚砜（DMSO）购自Merck公司。纯水用Milipore 2Q超纯水系统制得。2%绵羊红细胞、豚鼠血清均来自兰州大学实验动物中心。

红芪样品购自甘肃武都，经兰州大学药学院马志刚教授鉴定为多序岩黄芪H. polybotrys的根。干燥、粉碎后备用。

2 方法

2.1 提取与分离纯化 粉碎的红芪药材，用95%乙醇回流3次，后用60 ℃水提取3次，提取液浓缩至生药浓度1 g·L^-1，加入95%的乙醇至乙醇浓度达到30%，在4 ℃静置过夜，离心，收集沉淀，冷冻干燥得红芪粗多糖1（HPS1）。HPS1经Sevage 法脱蛋白[9]和H₂O₂除色素[9]后再次醇沉，透析，冷冻干燥。用水溶解后，经DEAE-cellulose 52 柱色谱（2.6 cm ×70 cm），用0.1 mol·L^-1 NaCl洗脱，苯酚-硫酸法示踪，收集主要馏分，后经Sephadex G-100（2.6 cm×90 cm） 柱色谱，蒸馏水洗脱，得到HPS1-D均一组分。

2.2 多糖的理化性质 总糖质量分数的测定用苯酚硫酸法[10]，蛋白质含量测定用Bradford 法[11]；糖醛酸的鉴定与质量分数测定使用气相色谱法和硫酸-咔唑法[10]；全波长紫外扫描；多糖中碳（C）、氢（H）、硫（S）元素分析采用元素分析仪进行分析。

2.3 单糖组成分析 取HPS1-D样品10 mg，采用GC分析[12]单糖组成。混合的单糖对照品直接乙酰化后GC分析。

2.4 部分酸水解[10] 取样品HPS1-D 100 mg用0.1 mol·L^-1 TFA 100 ℃水解1 h，冷却至室温后于60 ℃减压旋蒸除去TFA，加入1.5 mL甲醇溶解，减压蒸干，重复3次，除尽TFA。用蒸馏水溶解，透析（3500）。袋内部分经Sephadex-100柱色谱纯化后得到次级多糖组分HPS1-D-H；袋外部分经Sephadex-25柱色谱纯化得一低聚糖HPS1-D-L和混合的单糖组分。将HPS1-D-H，HPS1-D-L水解后进行GC分析。

2.5 甲基化分析 按Needs法[13]对HPS1-D进行甲基化反应。经IR分析检测甲基化完全后，用88%甲酸100 ℃水解3 h，然后加2 mol·L^-1的TFA 120 ℃水解3 h，去酸后还原，乙酰化，GC-MS分析。

气相色谱条件：柱温175 ℃；载气为氦气；进样口温度210 ℃；载气体积流量1.00 mL·min^-1；进样模式为分流；分流比50.0；进样体积1 μL。

质谱条件：离子源温度200 ℃；接口温度210 ℃；溶剂延迟4 min；阈值1 000；起始时间为4.00 min；结束时间为14.83 min；采集方式为Scan；扫描范围m/z 33.00～630.00。

2.6 NMR分析 精密称取充分干燥的HPS1-D 15 mg，溶于0.5 mL 重水中，冷冻干燥，如此重复用重水交换3次，再溶于0.5 mL重水后，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过后在Bruker DRX-600 核磁共振光谱仪上进行¹H，¹3C-NMR 分析。

2.7 绝对分子质量、分子构象及相对分子质量分布 凝胶渗透色谱和光散射联用（GPC-MALLS） 为绝对方法，可直接测定重均分子量（Mw），多分散系数（Mw/Mn），均方根旋转半径（Rg）。GPC-MALLS联用技术测定相对分子质量时受样品结构及相对分子质量限制小，不依赖泵流速，不需要对照品作对照，就可直接测得重均分子量，更重要的是，该技术还可提供样品在溶液状态下构象信息。

采用凝胶渗透色谱与光散射仪（GPC-MALLS）联用技术测定其绝对分子质量、分子构象及相对分子质量分布，流动相为0.9% NaCl与质量分数为0.02% NaN₃的混合溶液。色谱柱为凝胶渗透色谱柱UltrahydrogelTM 1000，500 串联，体积流量0.8 mL·min^-1，柱温30 ℃，示差折光检测器温度为35 ℃。

2.8 HPS1-D抗补体活性的研究 补体经典途径的溶血活性（CH₅₀）测定[15] 。通过补体测试，1∶40豚鼠血清作为最低溶血浓度的补体浓度，与供试品混匀加各试剂，见表1， 37 ℃水浴30 min 后低温离心10 min，取每管上清液0.2 mL，用酶标仪在405 nm 下测定吸收度。以HPS1-D浓度作为X轴，溶血抑制率作为Y轴作图，计算CH₅₀。肝素作为阳性对照药。

表1 补体经典途经溶血实验中所加各成分的体积

Table 1 Volume of components for hemolysis assay on the classic pathwaymL

3 结果与讨论

3.1 多糖的分离与纯化 HPS1经DEAE-52分离，Sephadex G-100 排阻色谱分离得白色絮状红芪多糖HPS1-D，得率为0.8% 。经过HPLC-GPC检测，呈单一对称峰（峰面积归一化法计算质量分数在98.5%），说明该组分是均一多糖。

3.2 多糖理化性质 HPS1-D 的总糖质量分数为99.42%，蛋白质未检出，糖醛酸测定呈阴性，即不含有糖醛酸。全波长扫描在260，280 nm处没有吸收，说明不含核酸。元素分析C，H，S的质量分数分别为39.65%，6.24%，0.00%，经计算得O质量分数为54.11%，C，H，O 的摩尔比约为1∶2∶1，符合多糖的元素及组成比例，此结果也证明HPS1-D不含硫酸基。由于HPS1-D 不含糖醛酸，说明HPS1-D为中性多糖。

3.3 单糖组成分析 HPS1-D 经气相色谱分析后，用面积归一化法得HPS1-D的单糖组成及其比例为Ara-Glc（1.3∶7.2）。色谱图见图1，2。

1.鼠李糖；2.阿拉伯糖；3.木糖；4.甘露糖；5.葡萄糖；6.半乳糖；7.内标（图2同）。

图1 混合单糖对照品的气相色谱图

Fig.1 GC chromatogram of mixed monose reference substances

图2 HPS1-D 的气相色谱图

Fig.2 GC chromatogram of HPS1-D

3.4 部分酸水解分析 HPS1-D部分酸水解后经气相色谱对其单糖组成分析知，HPS1-D-L 的单糖组成及其比例为Glc-Ara（0.4∶2.3）；HPS1-D-H 的单糖组成仅为Glc。从部分酸水解结果可知主链骨架由葡萄糖组成，支链主要由阿拉伯糖组成，也有少量的葡萄糖存在于支链中。

3.5 甲基化分析 甲基化分析结果见表2。

表2 HPS1-D甲基化结果

Table 2 Methylating results of HPS1-D

3.6 NMR分析 HPS1-D 的NMR分析后数据见表3。参考文献报道的α-L-Araf 异头碳的化学位移位于δ 113.4～107.6；α-D-Glcp 异头碳的化学位移位于δ 102.0～100.0。因此可以确定HPS1-D 中的阿拉伯糖为α-L-Araf；葡萄糖为α-D-Glcp。由碳谱和氢谱的数据推知多糖HPS1-D 的主要连接方式与甲基化的结果一致。

表3 HPS1-D 的¹H-NMR 和¹3C-NMR 化学位移

Table 3 ¹H-NMR and ¹3C-NMR chemical shifts of HPS1-D

注：-.图谱中未解析出此位置的归属。

3.7 绝对分子质量、分子构象及分子质量分布分析 采用示差折光检测器和激光检测器分别记录供试品质量浓度和供试品在不同角度的光散射强度；dn/dc为0.138，通过多角度激光散射仪自带ASTRAV 软件计算得到HPS1-D的绝对分子质量为5.236×10⁵，分布指数d=Mw/Mn=1.231；以均方根旋转半径对摩尔质量作图，见图3，得到的斜率为0.51，说明HPS1-D的构象为线性无规则线团；HPS1-D的分子质量分布指数为1.974，说明HPS1-D分子量为窄分布样品，即表明摩尔质量分布范围集中。

3.8 多糖抗补体活性分析 HPS1-D的抗补体活性CH₅₀为（0.21±0.03） g·L^-1，阳性对照肝素的抗补体活性CH₅₀为（0.19±0.05） g·L^-1，见图4，表明HPS1-D在经典途径中有较好的抗补体活性。

图3 HPS1-D均方根旋转半径对摩尔质量图

Fig.3 Root mean square turning radius

图4 HPS1-D和肝素的经典途径的抗补体活性

Fig.4 Anti-complementary activity on the classic pathway of HPS1-D and heparin

4 讨论

综上分析可知HPS1-D主链骨架由1，4和1，4，6-α-D-Glcp，侧链分支位于葡萄糖O-6位。侧链分支主要由1，5和1，3，5-α-L-Araf组成，可能还有少量的1，4链接的葡萄糖存在。主链末端位为葡萄糖，而侧链末端主要由阿拉伯糖组成，可能有少量的葡萄糖。因此HPS1-D主要由葡萄糖和阿拉伯糖组成，并且HPS1-D在0.9% NaCl盐溶液中的构象为无规则线团形态。抗补体活性表明，HPS1-D在经典途径中有较好的抗补体活性，这显示了HPS1-D治疗补体过度激活相关疾病的潜在价值，具体的激活机制还在进一步研究中。

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Chemical structural features and anti-complementary activity of

polysaccharide HPS1-D from Hedysarum polybotrys

YANG Tao， GUO Long， LI Can， YANG Ying-lai， FENG Shi-lan

（School of Pharmacy， Lanzhou University， Lanzhou 730000， China）

[Abstract] HPS1-D， an active polysaccharide，was isolated and purified from Hedysarum polybotrys.HPS1-D was obtained after treated with Savage method and H₂O₂ ， and purified with DEAE-cellulose 52 and Sephadex G-100 gel filtration chromato- graphy. Then physicochemical property analysis， GC， methylation， partial acid hydrolysis， and NMR method were used to study chemical structural of HPS1-D. The conformation was primarily analyzed with GPC-MALLS method and Congo red reaction. The anti-complementary activity of HPS1-D was evaluated with the hemolysis assay. HPS1-D was a heteropolysaccharide and consisted of D-glucose， L-arab inose，（7.2∶1.3）. HPS1-D proved to be a neutral sugar， with 1， 4-and 1， 4，6-α-D-glucopyranosyl residues in backbone ，and 1， 5-and 1， 3， 5-α-L-arabinofuranosyl residues in branches. HPS1-D has a random coil state conformation with monodisperse mass distribution in 0.9% NaCl solution. And HPS1-D had triple-helix conformation in concentrate of NaOH solution .Anti-complementary activity of HPS1-D was closed to its positive control heparin.

[Key words] Hedysarum polybotrys； polysaccharide； chemical structure； conformation； anti-complementary

doi：10.4268/cjcmm20140118

[责任编辑 孔晶晶]